《Journal of Cell Communication and Signaling》：Mendelian randomization analysis identifies HLA-A and AP2M1 as genetic biomarkers linked to immune–endocytic crosstalk in intervertebral disc degeneration
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本文通过整合孟德尔随机化（MR）分析、单细胞转录组数据与功能实验，首次系统性阐明内吞作用相关基因在椎间盘退变（IVDD）中的致病机制。研究发现HLA-A和AP2M1是IVDD的关键遗传生物标志物，分别发挥风险与保护作用，并可通过调节细胞增殖、凋亡、内吞活性及免疫细胞（如巨噬细胞、嗜酸性粒细胞）浸润，影响mTOR等信号通路，为IVDD的早期诊断与靶向治疗提供了新方向。
引言
椎间盘退变（Intervertebral Disc Degeneration, IVDD）是脊柱外科常见的慢性退行性疾病，主要表现为椎间盘结构破坏、功能丧失，常引发腰痛、神经根病等症状。年龄、遗传、机械负荷等多种因素参与其发病过程。近年研究发现，免疫微环境紊乱与代谢失衡在IVDD进程中发挥重要作用，而内吞作用（Endocytosis）作为细胞内外物质交换的关键过程，其异常可能与IVDD的病理机制密切相关。然而，内吞作用相关基因（Endocytosis-Related Genes, ERGs）在IVDD中的具体作用尚未被系统阐明。
结果
1. 六种差异表达内吞作用相关基因的生物学功能
通过整合单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（数据集GSE199866）与批量转录组数据（GSE56081），研究团队进行了严格的质控分析。在纤维环（Annulus Fibrosus, AF）细胞中鉴定出1142个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs），在髓核（Nucleus Pulposus, NP）细胞中鉴定出1517个DEGs，合并去重后得到1798个DEGs（标记为DEGs1）。在GSE56081数据集中鉴定出7235个DEGs（标记为DEGs2）。将DEGs1、DEGs2与ERG数据库取交集，最终筛选出6个差异表达的内吞作用相关基因（DE-ERGs）。基因本体（GO）富集分析显示，这些基因显著富集于突触后膜神经递质受体水平调节、蛋白质复合物定位、突触后神经递质受体内吞等生物学过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析则显示，它们主要参与内吞作用、内分泌及其他因子调节的钙重吸收、突触小泡循环等通路。
2. HLA-A与AP2M1被鉴定为生物标志物
研究采用两样本孟德尔随机化（MR）分析方法，评估DE-ERGs与IVDD之间的因果关系。结果显示，HLA-A是IVDD的风险因素（比值比 Odds Ratio, OR = 1.04, 95% CI = 1.00–1.09），而AP2M1则表现出保护作用（OR = 0.93, 95% CI = 0.91–0.96）。散点图、森林图和漏斗图结果一致，敏感性分析和Steiger检验进一步验证了因果关系的稳健性与方向准确性。在训练集（GSE56081）和验证集（GSE15227）中，HLA-A和AP2M1在IVDD样本与对照样本间的表达水平均存在显著差异，证实了其作为生物标志物的潜力。
3. 生物标志物的功能分析
通过构建基因-基因相互作用（GGI）网络，发现HLA-A和AP2M1与囊泡内部、囊泡膜、货物适配体活性等功能密切相关。基因集富集分析（GSEA）显示，HLA-A显著富集于核糖体、自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞介导的细胞毒性、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target Of Rapamycin, mTOR）信号通路等21条KEGG通路；AP2M1则富集于17条通路，同样涉及内吞和免疫相关过程。
4. 巨噬细胞、嗜酸性粒细胞与生物标志物的高度相关性
利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）算法评估IVDD组织中的免疫细胞浸润情况。结果显示，与对照组相比，IVDD组织中活化的CD4+T细胞、活化的CD8+T细胞、活化的树突状细胞等18种免疫细胞比例发生显著改变。相关性分析发现，AP2M1的表达与巨噬细胞比例呈最强正相关（r = 0.9394, p < 0.001），与嗜酸性粒细胞比例呈最强负相关（r = -0.9758, p < 0.001），提示这些生物标志物与免疫微环境重塑紧密关联。
5. TF-生物标志物-miRNA调控网络
为阐明HLA-A和AP2M1的转录后调控机制，研究构建了microRNA-生物标志物调控网络，预测出hsa-miR-1275、hsa-miR-326等13个可能靶向这两个基因的miRNA。同时，利用ChEA3数据库预测了转录因子（Transcription Factor, TF）与生物标志物的相互作用，构建了一个包含2个生物标志物、46个TF和59个相互作用对的网络。其中，SPL1、USF1、RUNX3等13个TF被预测可同时调控HLA-A和AP2M1。这些发现整合成了一个全面的TF-生物标志物-miRNA调控网络，揭示了潜在的分子调控通路。
6. HLA-A与AP2M1通过调节内吞作用与免疫细胞浸润在IVDD中发挥保护作用
体外功能实验证实了HLA-A和AP2M1在IVDD中的关键作用。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验显示，过表达HLA-A或AP2M1可显著促进NP细胞和THP-1巨噬细胞的增殖，而敲低则抑制增殖。流式细胞术检测细胞凋亡发现，过表达这两个基因能显著降低NP细胞凋亡率，敲低则增加凋亡。吞噬实验表明，过表达HLA-A或AP2M1能增强NP细胞和THP-1细胞的内吞活性。此外，在共培养体系中，过表达HLA-A或AP2M1显著增加了巨噬细胞的比例，降低了嗜酸性粒细胞样HC15细胞的比例；敲低则产生相反效果。
进一步研究发现，使用mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）处理，可以逆转HLA-A或AP2M1过表达所诱导的细胞增殖增加、凋亡减少和内吞活性增强，表明HLA-A和AP2M1可能通过mTOR信号通路发挥调节作用。
7. HLA-A与AP2M1通过增强内吞作用在体内验证其对IVDD的保护角色
在大鼠IVDD模型中进行的体内实验进一步验证了上述发现。蛋白质免疫印迹（Western Blot, WB）分析显示，模型组IVD组织中HLA-A和AP2M1蛋白水平显著降低，而过表达处理能有效提升其表达。苏木精-伊红（H&E）染色和番红O-固绿染色显示，HLA-A和AP2M1过表达组的椎间盘结构更为完整，细胞排列有序；而敲低组则表现出典型的退变特征，如髓核区细胞数量减少、纤维环结构破坏。免疫组织化学、WB和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析一致表明，过表达HLA-A或AP2M1能显著提升IVD组织中mTOR、AKT、RAB5等与内吞活动相关蛋白和基因的表达水平。酶联免疫吸附测定（ELISA）显示，过表达这两个基因能显著降低IVD组织中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和IL-6等炎症因子的水平。此外，免疫荧光结果证实，过表达HLA-A或AP2M1能增加巨噬细胞浸润，减少嗜酸性粒细胞浸润。
讨论
本研究发现并验证了HLA-A和AP2M1作为IVDD潜在生物标志物的重要性。HLA-A是主要组织相容性复合体I类（MHC-I）的关键组分，在免疫调节中发挥核心作用，可能通过抗原提呈和激活T细胞、NK细胞参与IVDD进程。AP2M1是网格蛋白介导的内吞作用的核心组件，通过调控囊泡运输影响细胞信号传导和免疫微环境。MR分析表明二者与IVDD存在因果关系，功能实验证实它们能调控细胞命运和内吞活动，并通过mTOR等通路与免疫细胞（尤其是巨噬细胞和嗜酸性粒细胞）相互作用，共同影响IVDD的发展。这为理解IVDD中免疫与内吞的串扰机制提供了新视角。
结论
本研究通过整合生物信息学分析与体内外实验，首次鉴定出HLA-A和AP2M1是连接免疫失调与内吞功能障碍的IVDD潜在遗传生物标志物。它们参与调控核糖体功能、NK细胞介导的细胞毒性、mTOR信号通路等关键生物学过程，并与巨噬细胞、嗜酸性粒细胞等免疫细胞浸润密切相关。这些发现不仅深化了对IVDD分子机制的理解，也为该疾病的早期诊断、预后评估及开发新的靶向治疗策略提供了重要的理论依据和候选靶点。
