小干扰RNA（siRNA）介导的cAMP依赖性蛋白激酶调节亚基（CRP）的下调，能够降低禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）的致病性

《Physiological and Molecular Plant Pathology》：Small interference RNA (siRNA)-mediated down-regulation of a cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit ( CRP) results in reduced pathogenicity in Fusarium graminearum and Magnaporthe oryzae

本研究利用RNA干扰技术沉默氟胞菌和小麦锈斑病菌的CRP基因，发现siRNA显著抑制其菌落生长和病原性，并证实CRP在真菌致病中起关键作用，且该基因在真菌中具有保守性。

　　

Massarat Fatima | Katkuri Balakrishna | Ragiba Makandar

海得拉巴大学生命科学学院植物科学系，C.R. Rao路，Gachibowli，海得拉巴500046，印度

摘要

< />F. graminearum的致病过程。通过在无菌培养条件下对真菌分生孢子进行干预（体外实验），以及在小麦和拟南芥叶片上实施喷雾诱导的基因沉默（体内实验），成功实现了CRP基因的靶向沉默。结果显示，在处理后5天和7天时，CRP基因被沉默的F. graminearum菌落生长和生物量显著减少。当CRP基因沉默浓度达到35 nM时，F. graminearum的分生孢子生长受到50%的抑制，表现为菌丝末端出现聚集结构，并且分生孢子萌发能力减弱（体外实验）。为验证这些结果，还用CRP-siRNA处理了另一种半生物营养型真菌病原体Magnaporthe oryzae（体外实验）并在水稻叶片上进行了喷雾诱导的基因沉默（体内实验）。两种病原体实验均得到了相似的结果，证实了CRP基因在不同真菌物种中的保守性及其在真菌致病性中的作用。实时定量PCR（RT-qPCR）分析显示，与未处理对照组或无关siRNA处理组相比，CRP基因在体外和体内实验中均显著下调，进一步证明了CRP基因在真菌致病性中的作用。

引言

Fusarium graminearum是一种半生物营养型子囊菌，能在宿主植物中生存。它是全球小麦和大麦镰刀菌头枯病（FHB）的主要致病因子[1]。尽管采取了多种作物保护措施，并使用了去甲基化抑制剂（DMI）杀菌剂来减少产量损失和提高抗性，但目前尚无能够完全抵抗该病原体的方法。随着RNA干扰（RNAi）等现代技术的出现，人们得以深入研究F. graminearum的致病机制。RNA干扰（RNAi）作为一种潜在的害虫和病原体控制方法，已被用于保障全球粮食安全[2][3]。基于小干扰RNA（siRNA）的基因沉默技术作为反向遗传学工具，在植物及其他真核生物的功能基因组学研究中得到广泛应用[4]。 喷雾诱导的RNA干扰通过靶向真菌RNAi机制的关键成分，有效抑制了真菌的致病性。Werner等人（2020年）[5]的研究表明，在F. graminearum中沉默ARGONAUTE和DICER基因可显著减轻大麦病害。siRNA技术通过使用双链RNA（dsRNA）实现对目标基因的高度特异性转录后调控[6]。这种特异性基因沉默可通过mRNA降解或前体长链非编码双链RNA（dsRNA）分子与目标mRNA的序列互补性来实现。由于该技术需要喷洒siRNA，因此也被称为喷雾诱导的基因沉默（SIGS）。SIGS是一种现代的、非转化的、环境可持续的害虫和病原体管理策略，通过将裸露或纳米材料结合的dsRNA施用于叶片和幼果，选择性地敲低致病基因的表达[7][8]。RNA干扰（RNAi）作为一种非转基因策略，通过序列特异性沉默病原体基因，在真菌病害控制中展现出巨大潜力。早期研究证明，外源RNA分子能被真菌病原体有效吸收，并通过跨界或种间RNAi机制抑制其致病性[9]。 环腺苷酸（cAMP）依赖的信号通路对多种植物病原真菌的分化过程和感染过程至关重要。研究表明，在Magnaporthe oryzae中，cAMP/蛋白激酶A（PKA）信号通路对表面感应、附着器形成、膨压生成及植物感染调控至关重要[10][11]。在F. graminearum中，cAMP的唯一细胞内靶标是PKA的调节亚基，该亚基参与真菌生长调控、有性繁殖和霉菌毒素的产生[12]。先前研究还发现，在受到F. graminearum侵袭的小麦和拟南芥中，CRP基因（FGSG_09908）表达上调[13]。因此，我们推测CRP可能参与F. graminearum的致病过程。本研究采用SIGS技术在F. graminearum中沉默CRP调节亚基基因（FGSG_09908），并通过另一个宿主-病原体系统（M. oryzae和Oryza sativa）验证了这一假设。此外，外源dsRNA的应用也被证明能有效抑制F. graminearum的生长和病害传播，包括通过靶向几丁质合成酶、葡聚糖合成酶和蛋白激酶等关键基因[14][15]。RNA干扰已成功用于抑制真菌致病性和霉菌毒素的产生[16]。

植物材料与生长条件

实验所用的小麦、水稻和拟南芥材料分别来自新德里的国家植物遗传资源局（NBPGR）、海得拉巴的印度水稻研究所（IRRI）以及海得拉巴大学生命科学系。所用小麦品种为易感FHB病的Sonalika，模式植物为拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0，易感稻瘟病的品种为BPT-5204（Samba Mahsuri，O. sativa L.）。

CRP与其他子囊菌成员的系统发育关系

CRP蛋白激酶调节蛋白（CRP）编码一种包含399个氨基酸的蛋白质，具有蛋白激酶A（PKA）调节亚基的特征结构元素。比较多种真菌物种的CRP蛋白序列发现，它们均含有CAP（富含半胱氨酸的分泌蛋白，抗原5，与致病性相关的CAP-ED结构域，其ID为cd00038，详见表S2）[12]。

讨论

与哺乳动物不同，微生物病原体和害虫能够吸收环境中的小RNA（sRNA），这些非编码RNA在被吸收后仍保持RNAi活性[21][28]。这表明可以通过外源提供RNA来保护植物免受病原体侵害。RNAi方法利用与其目标mRNA序列互补的dsRNA分子精确沉默特定基因[29]。先前研究表明，这种技术具有可行性。

结论

本研究旨在探讨siRNA处理后的CRP基因对真菌形态、孢子形成及生物量的影响，并通过SIGS技术观察其对F. graminearum和M. oryzae在宿主植物上的影响。基因表达分析表明，CRP基因的沉默显著降低了真菌的感染和生长。由于CRP基因在真菌生物学过程中起着关键作用，因此这一发现具有重要意义。

作者贡献声明

Massarat Fatima：撰写初稿、方法设计、实验实施及数据分析。 Katkuri Balakrishna：撰写初稿、数据分析。 Ragiba Makandar：审稿与编辑、实验监督、资源协调、资金争取及研究概念构思。

伦理声明

本手稿未包含动物实验内容，也未涉及人类研究。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

数据获取

数据可应要求提供。

资金支持

本研究得到了印度科学技术部（DST）- SERB POWER项目的资助（项目编号：SPG/2021/001819，资助对象为RM）。