《Process Safety and Environmental Protection》：Machine learning optimization of Cr(VI) bioreduction using novel strain CR9 immobilized on compost-derived humic acid gel microspheres
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微生物还原剧毒六价铬（Cr(VI)）为三价铬（Cr(III)）是可持续的修复策略，但堆肥腐殖酸（cHA）与固定化Cr(VI)还原菌协同作用仍待研究。本文发现分离自污染土壤的Bacillus sp. CR9菌株在pH 6-9、25-40℃、0.5-2%盐度下均能高效还原Cr(VI)，其最大去除效率达98.97%。通过多尺度表征和亚细胞定位，证实CR9以胞外酶促还原为主，形成无定形Cr(OH)?沉淀。构建CR9-cHA-海藻酸钠（SA）生物微球，经ANN-JADE机器学习优化，在1.99% SA、3.19% cHA时实现73.02%的Cr(VI)去除率，较自由菌和土壤腐殖酸载体分别提升14.07%和12.66%。循环实验显示该复合体系连续18天稳定运行。
吴明辉|张涵|尹志艳|李文健|潘正勇|陈毅|张若彤|邱中平
西南交通大学生命科学与工程学院，中国四川省成都市610031
摘要
微生物将有毒的六价铬（Cr(VI)还原为稳定的三价铬（Cr(III)）是一种可持续的修复方法，然而，将堆肥衍生的腐殖酸（cHA）与六价铬还原菌的固定相结合的协同效应尚未得到充分研究。本文从受六价铬污染的土壤中分离出一种新的Bacillus sp. CR9菌株，该菌株在广泛的条件下表现出强劲的生长能力和六价铬的还原能力：pH值6-9、温度25-40℃、六价铬浓度50-200 mg/L、盐度0-2%以及接种量1-6%。在最佳条件下（pH值7、温度37℃、盐度1%、接种量5%），该菌株在48小时内完全还原了120 mg/L的六价铬。多方面的表征结合亚细胞定位分析表明，细胞外酶促还原是主要机制，形成了无定形的Cr(OH)?，同时细胞内/外的吸附和生物积累也起到了一定作用。此外，用cHA固定的CR9-cHA-SA生物微球在48小时内去除了220 mg/L六价铬中的60.04%，其效果分别比游离菌株和土壤衍生的HA固定生物复合材料高出14.07%和12.66%。通过ANN-JADE机器学习算法优化得到了最佳配方（15 mL悬浮液、3.19% cHA、1.99% SA），预测的六价铬去除效率为73.02%。实验验证结果显示实际去除效率为71.99%，证实了模型的准确性。循环实验表明O-CR9-cHA-SA具有18天的操作稳定性，这得益于其增强的结构稳定性和电子传递能力。这些发现突显了机器学习指导下的cHA-SA共固定技术作为原位六价铬修复方法的前景。
引言
铬（Cr）是一种具有战略重要性的金属，但其广泛的工业应用导致了水生和陆地环境的严重污染（Shi等人，2019年）。在自然界中，铬主要以两种稳定的氧化态存在：高毒性、易迁移且具有致癌性的六价铬[Cr(VI)]，以及相对惰性且容易沉淀的三价铬[Cr(III)]（Fu等人，2021年）。由于六价铬的高迁移性，它容易通过地下水和食物链扩散，对生态安全和人类健康构成严重威胁，因此被列为全球重点污染物（Gu等人，2023年）。因此，将六价铬还原为三价铬被广泛认为是有效的修复策略（吴明辉等人，2019年）。
传统的物理化学修复方法（如吸附和化学还原）常常受到高运行成本、能耗和二次污染风险等限制。相比之下，微生物生物修复是一种经济高效且环境友好的方法（吴明辉等人，2019年）。包括Pseudomonas、Bacillus和Shewanella在内的细菌可以通过特定的还原酶和电子传递途径将可溶性六价铬还原为毒性较低且不具迁移性的三价铬。然而，游离细菌细胞在实际应用中容易受到高浓度六价铬环境的损害，并且生物质与液体的分离也存在挑战，这限制了生物修复剂的重复使用和规模化应用（Gopi Kiran等人，2018年）。为了解决这些问题，人们开发了使用多孔或聚合物基质固定微生物的方法，以保护微生物免受重金属的直接威胁，从而提高修复效果。
微生物固定技术具有独特的优势，包括高稳定性、优异的生物活性、易于实现固液分离以及潜在的重复使用性。选择合适的固定载体对于环境修复的成功至关重要。腐殖酸（HA）是一种普遍存在的天然大分子化合物，由于其低成本、良好的生物相容性、高表面积和丰富的功能基团，成为一种有前景的载体（Hou等人，2020a）。HA可以通过吸附、络合和由酚类及羧基等功能基团介导的氧化还原反应与重金属相互作用（Hou等人，2019年）。此外，HA还充当有效的电子穿梭剂，在微生物和金属氧化物之间传递电子（Mohamed等人，2020年），从而促进六价铬和四价钚等重金属的还原（Xie等人，2018年）。我们之前的研究创新性地使用土壤衍生的HA（sHA）作为六价铬还原菌CRB-7的固定载体，结果表明sHA在促进细菌定植和六价铬还原方面具有独特优势，优于传统的载体（如生物炭和蛭石）（吴明辉等人，2022a；吴明辉等人，2019年）。
值得注意的是，堆肥是一种将有机废弃物（如秸秆、粪便）转化为富含腐殖酸产品的可持续方法（Said-Pullicino等人，2007年）。堆肥衍生的腐殖酸（cHA）因其稳定的结构和显著的高氧化还原特性而受到广泛关注（Yuan等人，2017年；Farrell和Jones，2009年）。最新研究表明，cHA不仅有助于氧化还原活性有机污染物的转化，还能增强微生物的细胞外电子传递，从而催化特定的还原过程，显示出促进六价铬还原为三价铬的巨大潜力（Yuan等人，2017年；Yang等人，2020年）。然而，尽管cHA具有这些优良特性，但目前尚不清楚它是否能够作为有效的载体来固定六价铬还原菌，从而建立协同修复系统。这一知识空白限制了对堆肥有机物功能的全面理解，阻碍了其在污染控制中的进一步应用。开发基于cHA的细菌固定系统可以带来双重好处：（1）创新的重金属修复策略；（2）为堆肥产品的增值应用开辟新途径。因此，系统性的研究对于阐明cHA固定六价铬还原菌的修复性能和协同机制至关重要。
为了优化cHA固定的CR9生物复合材料的合成，以实现对六价铬的有效修复，需要基于六价铬去除效果系统评估关键参数，如cHA、海藻酸钠（SA）和细菌溶液的浓度。以往的研究通过单因素实验或响应面方法（RSM）优化了微生物固定参数（吴明辉等人，2022a）。机器学习技术，特别是人工神经网络（ANN）模型，能够通过自适应学习算法有效映射非线性输入输出关系，具有强大的自学习能力、高准确性和处理大规模数据集的能力（吴明辉等人，2024年）。最近的研究表明，ANN在模拟和优化重金属吸附、厌氧硝化等过程方面表现出色（Zhang等人，2020年；?enol等人，2024年）。与RSM相比，ANN在捕捉和描述变量之间的非线性关系方面更为有效，并且在类似的实验设计下通常具有更好的拟合和预测准确性（?enol等人，2024年；Poirazi等人，2007年；Bing?l等人，2012年）。然而，关于优化cHA固定六价铬还原菌的微生物还原过程的文献较少。因此，通过基于ANN的方法优化cHA固定的生物复合材料对于推进六价铬修复技术和发展机制理解具有重要意义。
尽管取得了这些进展，但仍存在一些知识空白。首先，尽管cHA作为固定载体具有很大的潜力，但其与六价铬还原菌的协同效应尚未得到系统研究。其次，利用ANN模型优化cHA固定细菌系统中的六价铬还原过程的应用也尚未探索。
因此，本研究的目标是：（1）从制革厂污染的土壤中分离并表征一种高效六价铬还原菌株CR9，并优化其还原条件；（2）利用能量色散光谱（EDS）、透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）等微表征技术，结合细胞组分还原实验，阐明CR9菌株的还原机制；（3）合成并评估CR9-cHA-SA生物复合材料，其中CR9菌株被固定在从鸡粪堆肥中提取的腐殖酸中；（4）利用ANN进一步优化CR9-cHA-SA生物复合材料的最佳配方，并预测和验证其六价铬去除性能。
部分内容摘录
化学物质和材料
本研究使用的所有化学试剂均为分析级。重铬酸钾（K?Cr?O?）购自成都科隆化学试剂有限公司。培养基成分（包括蛋白胨、酵母提取物、氯化钠和琼脂粉）由上海阿拉丁生化科技有限公司提供。SA和sHA由上海麦克林生化科技有限公司提供。本研究中使用的cHA是根据实验室制备的鸡粪堆肥提取的。
六价铬还原菌株的分离与鉴定
首先，从受六价铬污染的土壤中筛选出9株具有高抗六价铬能力的菌株进行评估（图1a）。由于CR9菌株对六价铬的最低抑制浓度（MIC）为350 mg/L，且六价铬去除效率高达98.97%，因此选其为后续研究的靶标菌株。CR9的16S rRNA基因序列已存入NCBI GenBank数据库，编号为PX720719。随后，将该序列与NCBI数据库中的序列进行了比较。
结论
本研究展示了将堆肥衍生的腐殖酸（cHA）固定技术与人工神经网络（ANN）优化相结合，有效提升了六价铬的生物修复效果。从受污染土壤中分离出的新型Bacillus sp. CR9菌株在广泛条件下表现出强劲的生长能力和卓越的六价铬[Cr(VI)]还原能力。多尺度表征结合亚细胞分析表明，CR9主要通过还原酶介导的方式去除六价铬。
CRediT作者贡献声明
邱中平：监督、资金获取、概念构思。张若彤：可视化、方法学。陈毅：可视化、数据管理。潘正勇：可视化、软件、方法学。李文健：可视化、验证、研究。尹志艳：可视化、方法学、研究、数据管理。张涵：撰写初稿、研究、数据管理。吴明辉：撰写、审稿与编辑、监督、项目管理、研究、资金获取
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号42207021）、四川省自然科学基金（2025ZNSFSC0194和2024NSFSC0384）、四川省重点研发计划（2023YFSY0011、2023ZHCG0058）、中央高校基本科研业务费（2682024ZTPY012）以及中国烟草总公司四川烟草公司的科技项目（SCYC202409）的财政支持。
