《Separation and Purification Technology》：Smart nanofiltration membrane for cutting oligomeric soybean peptides
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pH响应型纳米过滤膜通过引入羧甲基壳聚糖调控孔径实现大豆肽高效分离，采用双pH梯度过滤可将分子量189-1450Da的肽类质量占比提升至89.35%。该膜通过胺基的质子化/去质子化动态调节表面电荷与孔径，同步去除大分子和小分子氨基酸，简化传统多级分离工艺。
张文琪|彭后一|王晨|Ju晓辉|李伟星
南京工业大学化学工程学院材料导向化学工程国家重点实验室，中国南京211816
摘要
肽类物质是通过蛋白质水解产生的，通常包含许多不同分子量的产物。为了获得特定分子量范围内的肽产品，通常在纯化过程中使用不同的膜。本文提出了一种智能纳滤（NF）膜，该膜在不同pH条件下具有特定的孔径，用于分离大豆肽。将羧甲基壳聚糖（CMCS）引入聚酰胺膜的界面聚合过程中。CMCS上丰富的胺基团通过质子化/去质子化作用实现pH依赖性的构象变化，从而通过调节进料溶液的pH值来调控膜表面电荷和有效孔径。实验表明，这种NF膜在pH 12时对胸腺肽（679 Da）的截留率为98.54%，而在pH 3时仅为40.84%。当在pH 12和pH 3下依次过滤酶解液时，189–1450 Da范围内的大豆肽渗透物的质量比从52.93%提高到了89.35%。这种智能膜能够同时去除大分子和小氨基酸，从而有效提取目标肽类。这种方法为使用单一膜纯化生物分子提供了创新途径，有望缩短纯化过程。
引言
生物活性肽由于其较小的分子量和优异的生物利用度，在食品和制药行业中得到广泛应用[1]。大豆肽是通过大豆蛋白的酶解产生的低分子量片段混合物。这些肽具有多种生理功能，包括增强营养吸收、免疫调节、血清脂质谱改善和抗氧化活性。小于1000 Da的肽占总肽含量的89%，其余部分为游离氨基酸和无机盐。主要的无机盐NaCl来源于发酵液中的pH调节剂。低分子量肽具有较高的生物活性、良好的营养吸收性和较低的致敏性。然而，从复杂的大豆蛋白酶解物中高效提取和浓缩目标肽类仍是一个主要挑战。目前的分离技术包括高效凝胶过滤色谱、反相液相色谱、离子交换色谱和膜分离。其中，膜分离具有操作简便、环境友好、高效以及保持肽生物活性等优点[2],[3],[4]。Yu等人[5]开发了一种具有强正电荷密度的纳滤（NF）膜，能够有效排除寡肽和氨基酸，同时允许类似分子量的中性或酸性物质通过。Zhang等人[6]通过溶菌酶和血红蛋白的共组装制备了孔径小于10 nm的无缺陷纳滤膜，并通过优化蛋白质浓度精确调控了膜结构和性能，该膜对牛血清白蛋白（BSA）的截留率为99.4%。为了获得特定的大豆肽，需要使用两种不同孔径的膜，这导致了一个较长的过程。
本文重点研究了响应刺激的膜，这类膜可以根据pH值、温度、光、电场或磁场动态调整其渗透性和分离特性[7]，应用于传感、药物输送和水处理[8],[9],[10],[11],[12],[13]。例如，pH响应膜通过调节pH值实现操作简便性，这种可调性使得生物分子的分离更加高效[14],[15],[16]。Zhang等人[17]通过在带负电的氧化石墨烯（GO）纳米片上接枝带正电的聚乙烯亚胺（PEI）制备了一种响应刺激的高性能膜。这种膜在pH 12时能去除阳离子亚甲蓝，在pH 2时去除阴离子甲基橙。PEI中的胺基团在酸性条件下膨胀，在碱性条件下收缩，从而实现膜孔径的动态调节。
本文提出利用富含胺基团的羧甲基壳聚糖（CMCS）通过界面聚合（IP）制备新型pH响应纳滤膜。胺基团的质子化诱导的构象变化通过调节pH值来控制膜孔径。我们计划在两种不同pH条件下通过过滤获得特定分子量的大豆肽，这意味着整个分离过程仅需使用一种膜。这种智能NF膜为缩短生物分离过程提供了新的方法。
材料与试剂
聚丙烯腈（PAN）超滤膜（平均孔径：50 nm）由山东兰泾膜工程有限公司（中国）提供。用于发酵液预处理的陶瓷膜（孔径500 nm）由南京工业大学国家科学园有限公司（江苏）生产。所用试剂均为市售产品：p-苯二胺（PPD，98%）、羧甲基壳聚糖（CMCS）、三乙胺（TEA）、聚乙二醇标准品（PEG）。
膜的结构表征
表面形态通过扫描电子显微镜（SEM）进行观察。如图3(a)所示，PPD和TMC的界面聚合形成了致密的结节结构。加入CMCS后（图3b-f），出现了明显的起伏特征。浓度越高，表面皱纹越明显[18],[19]。这种形态变化是由于水相粘度增加所致。较高的单体浓度促进了初始聚酰胺层的形成。
结论
通过将CMCS引入PPD和TMC的界面聚合过程中，制备了一种pH响应纳滤膜，用于纯化发酵液中189–1450 Da范围内的大豆肽。CMCS通过其聚合物结构中的胺基团的质子化/去质子化作用实现pH依赖性的构象转变，从而调节了膜表面性质和孔径。当在pH 12和pH 3下依次过滤酶解液时，
作者贡献声明
张文琪：撰写初稿、方法设计、实验研究、数据分析。彭后一：实验研究、数据分析、数据分析。王晨：数据分析、数据分析。Ju晓辉：撰写、审稿与编辑、项目监督、项目管理。李伟星：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金申请。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2022YFC2105104）、江苏省教育厅青兰计划以及江苏省“333项目的支持。
