《ChemSusChem》：An Integrated Engineering Approach to Intensify the Biocatalytic Metaraminol Synthesis
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本研究聚焦于生物催化合成间羟胺（metaraminol）过程中的关键瓶颈——胺转氨酶（CvATA）催化的转氨基步骤。文章通过系统研究揭示了产物收率受限的根本原因在于严重的副产物形成，包括底物氧化、亚胺生成以及产物与辅因子PLP的加合物生成。研究团队通过优化酶制剂形式、大幅提高酶浓度以及整合连续原位产物移除（ISPR）系统，成功将间羟胺产率提升至>99%，浓度达到75 mM。这项工作为其他胺类化合物的生物催化合成提供了重要的优化蓝本。
1 引言
3-[(1R,2S)-2-氨基-1-羟基丙基]苯酚，通常被称为间羟胺（metaraminol），是一种手性氨基醇，作为活性药物成分（API）在治疗低血压方面具有重要作用，同时也是合成具有抗肿瘤、抗寄生虫或抗胆碱能效应的四氢异喹啉（THIQ）类化合物的关键砌块。目前其生产主要依赖金属催化剂、二氯甲烷等有毒溶剂以及化石原料，资源效率有限。作为一种更环保、更简单的替代方案，前人研究开发了一种两步酶法合成路线。该路线第一步由来自巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）的丙酮酸脱羧酶变体（ApPDC）催化3-羟基苯甲醛与酰基供体（如丙酮酸或乙醛）进行羧基连接反应，生成(R)-3-羟基苯乙酰基甲醇（(R)-3-OH-PAC）。第二步则利用来自紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的胺转氨酶（CvATA），将供体分子（如异丙胺（IPA）或L-丙氨酸）的氨基转移至底物(R)-3-OH-PAC，生成目标产物间羟胺。与其他胺转氨酶一样，CvATA依赖于辅因子5’-磷酸吡哆醛（PLP），该辅因子在反应机理中可自我再生，因此无需外部再生系统。
然而，尽管此前研究表明该整体反应方案可行，且羧基连接步骤已可实现高收率和高选择性，但转氨基步骤仍然充满挑战。当使用异丙胺（IPA）作为胺供体时，反应平衡严重偏向底物一侧，虽然其副产物丙酮可通过蒸发去除以推动平衡，但系统性研究仍然缺乏。另一方面，L-丙氨酸是一种无毒、生物基的替代品，但其转氨反应同样受不利的热力学平衡支配，需要额外的原位产物移除（ISPR）策略。此前研究已建立了使用油酸作为反应萃取剂的物理和反应萃取方法，但尚未实现底物的完全转化，影响了过程的生产率。本研究旨在对从(R)-3-OH-PAC胺化开始的酶法间羟胺合成进行完整表征，以确定可能的限制因素和过程强化策略，从而最大化产率、选择性和效价。
2 结果与讨论
2.1 使用异丙胺作为胺供体的间羟胺合成反应工程策略
初步研究采用冻干细胞作为催化剂。当底物(R)-3-OH-PAC浓度从40 mM逐步增加至160 mM（异丙胺过量6.25倍）时，间羟胺产量在底物浓度40至120 mM范围内最高达到20 mM，而在160 mM时仅产生7 mM，产率从50%持续下降至5%。这表明可能存在底物抑制，该抑制效应随底物浓度增加而增强。同时，异丙胺浓度在低于1 M时对产物形成速率几乎没有影响，但在1 M时也会导致速率下降，可能与辅因子解离导致的酶失活有关。通过底物补料、胺供体补料及施加真空移除丙酮等方法，均未能将间羟胺浓度提升至20 mM以上，表明除了潜在的底物抑制，还有其他限制因素。
2.2 副产物形成的鉴定
2.2.1 间羟胺与PLP之间的加合物形成
研究发现，当将0.1 mM PLP与20 mM间羟胺在缓冲液中混合时，PLP特征性的黄色在约10分钟内消失，溶液变为无色。分光光度研究表明，在间羟胺存在下，PLP在约390 nm处的原始吸收峰在1分钟内移至410 nm，符合希夫碱的形成。随后，该峰在10分钟内几乎消失，同时在325 nm处形成新的吸收峰，可能表明形成了吡哆胺-5‘-磷酸（PMP）。液相色谱-质谱（LC-MS）分析证实形成了一个质荷比（m/z）为397.2 [M+H]+的间羟胺-PLP复合物。量子力学计算模拟的吸收光谱支持该副产物可能是氧杂环戊烷化合物或 Pictet–Spengler 反应产物。该加合物的形成消耗了反应体系中的PLP，可能影响了CvATA的催化循环，因为CvATA与其他胺转氨酶相比具有较低的PLP结合亲和力。然而，在不同时间点补加PLP并未能提高间羟胺效价。
2.2.2 (R)-3-OH-PAC形成多种副产物
在使用冻干全细胞CvATA的一些实验中，尽管(R)-3-OH-PAC浓度下降，但几乎检测不到间羟胺合成。高效液相色谱（HPLC）图谱中出现了新的峰。LC-MS分析显示，在11分钟洗脱的副产物质荷比为166.1 [M+H]+，这提示可能是(R)-3-OH-PAC的氧化产物1-(3-羟基苯基)丙烷-1,2-二酮。此外，在13分钟洗脱的组分检测到前体质量为208.1 Da，可能是(R)-3-OH-PAC与胺供体IPA形成的亚胺。这些结果表明，生物催化间羟胺合成受到严重的副产物形成的阻碍，且副产物的形成似乎比间羟胺合成更快。
2.3 通过改变CvATA浓度和制剂形式克服间羟胺生产限制
为了克服此前约20 mM的间羟胺生产限制，研究测试了不同的CvATA浓度和制剂形式。首先增加了携带CvATA的冻干全细胞的浓度。结果表明，添加的生物催化剂浓度的增加与间羟胺产量的增加相关。当使用30 mg·mL-1全细胞时，达到了最高的间羟胺浓度38 mM，相当于约50%的产率。然而，高浓度的全细胞会增加反应溶液的粘度，损害体系中的传质，且细胞可能滞留产物。
因此，研究将CvATA制剂从全细胞改为纯化的冻干CvATA。使用恒定的6 mg·mL-1纯化CvATA（按Bradford法测定，冻干粉中60%为CvATA），测试了40至120 mM的(R)-3-OH-PAC浓度。在40 mM (R)-3-OH-PAC时，24小时后实现了完全转化（>99%）。在高达80 mM (R)-3-OH-PAC时，间羟胺产率>95%，最高绝对浓度达到75 mM。而初始浓度为120 mM时，最高产率为53%。综合来看，使用60 mM (R)-3-OH-PAC作为初始底物是实现高产率（>99%）和高绝对浓度（61 mM）的最佳平衡点。尽管使用如此高浓度的纯化酶在过程中可能非常昂贵，但成本可通过酶的固定化和后续重复使用来降低。
2.4 采用ISPR连续加工以提高以L-丙氨酸为胺供体的产率
为了采用更可持续的胺供体，研究将胺供体改为生物基的L-丙氨酸，并结合了原位萃取方法。连续实验运行了70小时，采用同步正向和反萃取。在中等泵速（2 mL·min-1）下评估了不同酶浓度（0.5、2和10 mg·mL-1）。在所有三种情况下，转化率几乎线性增加，更高的催化剂负载导致更陡的斜率，表明反应动力学是限速步骤，而向有机相的传质和泵速足够快。根据所选的催化剂负载，基于30 mM初始(R)-3-OH-PAC浓度，最终实现了10%至97%的转化率。由于实验结束时斜率仍呈线性，延长反应时间很可能达到≥99%的产率。最高酶浓度（10 mg·mL-1）在70小时后达到97%转化率。这些结果表明，可持续的共底物L-丙氨酸也可以成功应用，但该连续方法需要额外的装置和溶剂使用。
3 结论
本研究旨在提高间羟胺的总产率和效价。在使用异丙胺作为胺供体的反应体系中，发现了20 mM的间羟胺生产限制。通过表征和优化胺转氨酶催化反应，研究揭示了几种副反应是间羟胺合成的主要障碍。一方面，发现了辅因子PLP与目标产物间羟胺之间形成Pictet–Spengler产物和氧杂环戊烷产物。另一方面，底物(R)-3-OH-PAC在水相反应体系中的氧化以及亚胺形成直接与酶法间羟胺合成竞争。尽管使用纯化酶成本高昂，但在本研究中，应用纯化的CvATA提高了间羟胺效价和产率。通过将纯化CvATA浓度增加至6 mg·mL-1，间羟胺效价提高了3.8倍。此外，针对异丙胺反应体系，测得的时空产率（STY）高达5.2 g·L-1·h-1，比之前发表的方法高出8.6倍。最终将反应转移到连续产物萃取系统，使用生物基胺供体L-丙氨酸，在70小时后获得了97%的可比间羟胺产率，时空产率为0.7 g·L-1·h-1，略高于之前发表的萃取实验。通过提高初始(R)-3-OH-PAC浓度，相信时空产率还可以进一步提高。对已具备功能的CvATA进行工程化改造，以提高其底物亲和力，对于减少所用转氨酶浓度同时提高催化剂生产率至关重要。
本研究及先前相关出版物表明，间羟胺的酶法合成可以被成功建立。通过研究该反应，我们能够识别并克服转氨酶反应的限制，为在工业规模测试其应用铺平了道路。重要的是，本研究的发现和优化策略也可以转移到其他具有挑战性的胺类或API的合成中。
