《Synthetic and Systems Biotechnology》：De novo biosynthesis of 1,5-diamino-2-hydroxypentane from glucose via combination of fermentation and whole-cell catalysis
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本研究针对新型脂肪族β-氨基醇1,5-二氨基-2-羟基戊烷（2-OH-PDA）高效绿色合成难题，开发了一条从葡萄糖出发的生物合成新路径。研究人员首先在高产L-赖氨酸的E. coli NT1003中构建了3-羟基赖氨酸（3-OH-lysine）的合成路径并完成优化，随后利用赖氨酸脱羧酶（SpLDC）全细胞催化将其高效转化为2-OH-PDA。该研究最终实现了29.2 g/L的2-OH-PDA产量，摩尔转化率高达99.7%，为2-OH-PDA的经济、高效、绿色生物制造提供了可行的解决方案。
在合成与药物化学领域，β-氨基醇是一类重要的结构单元，兼具氨基（–NH2）和羟基（–OH）官能团，使其能够形成氢键并与金属配位，因而广泛应用于多种生物活性分子的构建，甚至是某些关键抗生素的核心药效团。然而，相较于已被深入研究的芳香族和环状β-氨基醇，那些具有新颖结构和多重官能团的脂肪族β-氨基醇的报道却非常有限，其潜力远未被充分发掘。
1,5-二氨基-2-羟基戊烷（2-OH-PDA）就是这样一种具有独特吸引力的分子。它与传统的生物基二胺（如腐胺或尸胺）不同，其结构包含一个β-氨基醇单元和一个在脂肪链上空间分离的伯胺基团。这种独特的排列赋予了它更高的极性、金属络合能力以及可调节的交联特性，使其在不对称合成、智能聚合物材料和环保固化配方等领域具有广阔的应用前景。然而，化学合成2-OH-PDA面临区域选择性差、立体选择性有限、反应条件苛刻以及反应中间体不稳定等诸多挑战，至今尚未有高效化学合成方法的报道。因此，探索生物合成路径势在必行。
先前的研究已经证明可以通过酶法或全细胞催化从L-赖氨酸合成2-OH-PDA，但这些方法严重依赖于价格昂贵的外源性底物L-赖氨酸和辅底物α-酮戊二酸（α-KG），极大地限制了其工业化应用的经济性。为了从根本上解决这一成本瓶颈，开发一条从更廉价、更易得的碳源（如葡萄糖）出发的从头生物合成路线，成为了一项极具价值的研究目标。
为此，研究团队在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表了一项创新性研究，成功构建了一条从葡萄糖到2-OH-PDA的两步式生物合成新路径。他们首先利用一株高产L-赖氨酸的工程大肠杆菌（E. coli NT1003）作为底盘，在其中异源表达了Fe2+/α-KG依赖的L-赖氨酸-3-羟化酶（K3H），从而构建了能够从葡萄糖从头合成3-羟基赖氨酸（3-OH-lysine）的菌株。随后，他们采用了赖氨酸脱羧酶（SpLDC）进行全细胞催化，将发酵得到的3-OH-赖氨酸高效地转化为最终产物2-OH-PDA。
为开展这项研究，作者主要运用了以下几个关键技术方法：首先是代谢工程与菌株构建，以高产L-赖氨酸的E. coli NT1003为底盘，通过质粒构建与转化引入K3H基因，创建了3-OH-赖氨酸的从头合成菌株。其次是发酵工艺优化与放大，在摇瓶水平系统优化了温度、时间、诱导剂浓度、底物及辅因子（葡萄糖、α-KG、Fe2+）等参数，并将工艺成功放大至5升生物反应器进行补料分批发酵。第三是基因表达水平的精细调控，通过核糖体结合位点（RBS）和启动子工程来优化K3H基因的转录与翻译效率。第四是辅底物供给系统的创新构建，通过共表达L-谷氨酸氧化酶（LGOX）和过氧化氢酶（CAT），建立了以廉价L-谷氨酸为原料、在胞内原位生成α-KG的供给系统，替代了昂贵的外源添加。最后是全细胞生物催化，构建并优化了表达SpLDC的工程菌，以其作为全细胞催化剂，高效催化3-OH-赖氨酸的脱羧反应。
3.1. 构建3-OH-赖氨酸的从头合成菌株
研究成功构建了工程菌株E. coli NT1003-pTrc99A-K3H，通过SDS-PAGE证实了K3H的可溶性表达。该菌株在摇瓶发酵中可产生2.3 g/L的3-OH-赖氨酸，验证了从头合成路径的功能性。从葡萄糖到3-OH-赖氨酸的合成路径示意图清晰地展示了这一过程。
3.2. 摇瓶发酵生产3-OH-赖氨酸的参数优化
研究人员系统优化了摇瓶发酵的关键参数。结果表明，最佳条件为：诱导温度25°C，培养时间72小时，IPTG浓度0.5 mM，初始葡萄糖浓度10 g/L，α-KG添加量100 mM，Fe2+浓度1 mM。在此条件下，3-OH-赖氨酸产量达到9.65 g/L。参数优化过程及效果通过一系列图表进行了详细展示。
3.3. K3H基因表达强度的优化
为了进一步提高产量，研究对K3H基因的表达水平进行了精细调控。通过测试不同强度的RBS和启动子，发现采用中等强度的RBS B0032和强启动子PJ23100的组合效果最佳，能将3-OH-赖氨酸产量提升至14.91 g/L，相比原始Trc启动子提高了30%。然而，增加K3H基因拷贝数并未带来产量上的进一步显著提升，表明转录/翻译能力或代谢压力可能已成为限制因素。基因工程优化策略及其效果对比图清晰地呈现了这些发现。
3.4. 构建L-谷氨酸驱动的α-KG供给系统
为降低辅底物成本，研究构建了一个由L-谷氨酸氧化酶（LGOX）和过氧化氢酶（CAT）组成的α-KG原位供给系统。该体系能将廉价的外源L-谷氨酸转化为α-KG，并消除反应产生的过氧化氢。将此系统与优化的K3H表达平台整合，构建了工程菌株T。实验证明，该菌株在不添加外源α-KG、仅提供L-谷氨酸的情况下，可在摇瓶中生产9.66 g/L的3-OH-赖氨酸，而对照菌株则无法合成。在5升生物反应器中，菌株T的补料分批发酵最终实现了40.2 g/L的3-OH-赖氨酸产量，且残余L-赖氨酸极少。这一系统将α-KG的原料成本降低了约20倍，凸显了其经济优势。α-KG供给系统原理及工程菌株性能通过示意图和对比数据得以阐明。
3.5. 全细胞催化合成2-OH-PDA
最后，研究利用表达赖氨酸脱羧酶SpLDC的工程大肠杆菌全细胞作为催化剂，将发酵获得的3-OH-赖氨酸转化为2-OH-PDA。通过优化反应温度、pH和辅因子磷酸吡哆醛（PLP）的浓度，确定了最佳反应条件为42°C、pH 6.0、PLP浓度0.5 mM。在此最优条件下，40.2 g/L的3-OH-赖氨酸在3小时内被高效转化为29.2 g/L的2-OH-PDA，摩尔转化率高达99.7%，质量收率为0.726 g/g，体积生产率达到9.73 g/L/h。该步骤的转化效率远超此前文献报道。SpLDC催化反应优化过程及高效转化结果通过图表和数据进行了全面展示。
综上所述，本研究成功报道了首条从葡萄糖出发，经由发酵与全细胞催化两步法实现2-OH-PDA从头生物合成的路线。其核心结论与重要意义在于：第一，该工作通过整合高产L-赖氨酸的底盘菌、K3H羟化酶以及谷氨酸驱动的α-KG供给模块，在5升生物反应器中实现了40.2 g/L的3-OH-赖氨酸产量，完全摆脱了对昂贵外源L-赖氨酸和α-KG的依赖，大幅降低了原料成本。第二，后续利用SpLDC进行的全细胞脱羧催化表现出近乎定量的转化效率（99.7%），最终获得29.2 g/L的2-OH-PDA，证明了该生物催化步骤的高效性与可行性。尽管过程中仍需添加外源L-谷氨酸，但其作为低成本、可规模化的原料，相比α-KG显著简化了工艺复杂度并提升了经济性。这项研究不仅为2-OH-PDA这一具有独特价值的多功能β-氨基醇提供了一条经济、高效且绿色的生物制造新途径，更重要的是，其所采用的模块化策略——即耦合内源性前体高产、辅底物供给与酶级联催化——为其他多功能氨基酸醇乃至更多高附加值化学品的生物合成提供了一个可推广的通用蓝图，对推动生物制造在合成化学与材料科学领域的应用具有重要意义。
