工业链霉菌中基因表达元件库的构建及其在优化天然产物生产中的应用

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Construction of a library of gene expression elements in industrial Streptomyces and its application

本论文针对工业链霉菌中遗传元件（如启动子和核糖体结合位点RBSs）适用性差的问题，建立了一种高效、低成本的定制化基因表达元件库（GEEL）构建策略。研究人员在ε-聚-L-赖氨酸（ε-PL）生产菌株白色链霉菌GS114和产那他霉素菌株橘橙链霉中成功构建并应用了GEEL。通过优化关键基因pls和sgnM的表达，分别将ε-PL产量提高至4.73 g/L，较对照提高了2.13倍，并增强了那他霉素的合成。该策略为工业链霉菌中关键靶标的精确调控提供了基础工具包，极大地推动了天然产物生物合成的理性工程改造。

　　

微生物界的“工厂经理”为何效率不高？

在微生物的世界里，链霉菌家族是赫赫有名的“化工厂”，为我们生产了众多不可或缺的天然产物，从农用抗生素、食品防腐剂到拯救生命的药物，都离不开它们。然而，随着人类需求的增长，这些“工厂”的原始产能已显不足。传统上，人们通过随机诱变的方式“碰运气”，希望得到高产菌株，这就像给工人（菌株）施加巨大压力，期望他们突然超常发挥，效果有限且难以持续。更先进的代谢工程和合成生物学方法则试图扮演“精明经理”的角色，通过精准改造生产线（代谢通路）来提升效率。但这需要一套通用的、高效的“指令手册”——基因表达元件（如启动子和核糖体结合位点RBSs）。问题在于，在模式链霉菌中运行良好的指令手册，拿到经过无数次诱变筛选、基因组背景已发生巨大变化的工业链霉菌“工厂”里，常常会“水土不服”，指令效果大打折扣甚至失效，严重制约了通过理性设计进一步增产的潜力。那么，能否为每个工业菌株量身定制一套专属的、高效的“指令库”呢？

为了回答这个核心问题，江南大学工业生物技术教育部重点实验室的李尚昱、朱道俊等人开展了一项开创性研究。他们开发了一种经济、高效的定制化基因表达元件库构建策略，并在两种重要的工业链霉菌——生产ε-聚-L-赖氨酸的白色链霉菌GS114和生产那他霉素的橘橙链霉中成功应用。这项研究成果已发表在合成生物学领域的重要期刊《Synthetic and Systems Biotechnology》上。

为了完成这项研究，作者们主要运用了以下几种关键技术方法：

1. 1.
   混合连接系统（MLS）：基于Gibson组装技术建立，能一次性将多达90个混合DNA片段与载体高效连接，显著降低了构建文库的时间和成本。
2. 2.
   基因表达元件功能表征：筛选并确定了β-葡萄糖醛酸酶基因gusA作为在工业链霉菌中最稳定、动态范围最广的报告基因，用于评估启动子和RBS的活性强度。
3. 3.
   单拷贝位点特异性整合与单轮接合技术：将构建好的元件库质粒通过一次接合转移导入工业链霉菌宿主，并利用φC31整合酶系统实现单拷贝基因组整合，避免了繁琐的多轮转化步骤，实现了文库在宿主中的高通量引入和筛选。

研究结果

3.1. 在工业链霉菌中评估报告基因系统

研究人员首先在工业菌株白色链霉菌GS114中，系统评估了eGFP、GUS和XylE三种常用报告基因的性能。他们发现，用不同报告基因测得的启动子活性排序存在差异，且与文献中在模式菌株中报道的排序并不一致。这证实了为模式菌株开发的元件在工业菌株中可能不适用。综合比较后，gusA因其在转录与翻译水平间最高的相关性（R²= 0.98）和最宽的动态范围（125倍）被选为最优报告基因。

3.2. 混合连接系统的设计、构建与优化

为了高效构建元件库，研究团队开发了混合连接系统（MLS）。通过优化载体与插入片段的最佳摩尔比（8：1）和混合片段数量（最高90个），该系统能在一次反应中组装多达60个启动子或30个RBS片段，且阳性克隆率超过85%，实现了低成本、高通量的文库构建。

3.3. 为白色链霉菌构建基因表达元件库（GEELs）

利用优化后的MLS，研究者在白色链霉菌GS114中成功构建了包含60个启动子的初始文库。通过单轮接合导入菌株，并结合基于GUS活性的筛选，最终获得了包含30个不同强度启动子和14个不同强度RBS的定制化GEELs。这些元件在摇瓶和24孔板等不同培养条件下显示出稳定的相对表达强度。

3.4. 利用GEELs优化pls表达以提升白色链霉菌的ε-PL产量

ε-聚-L-赖氨酸合成酶基因pls是增产的关键靶点。研究者从定制库中选取了5个启动子（P_SP26, P₂₁, P_SP20, P_SP4, P_C4-14）和3个RBSs（R_SR36, R_R15, R_SR11），通过MLS组合成15种不同的表达盒并导入GS114。摇瓶发酵结果显示，最优组合（P₂₁-R_R15）使ε-PL产量达到4.73 g/L，较对照菌株（2.35 g/L）提高了2.13倍，且发现并非最强的启动子与最强的RBS组合总能获得最佳效果，强调了启动子-RBS协同作用的重要性。

3.5. 在橘橙链霉中构建GEELs及其功能表征

为了验证该策略的普适性，研究团队在工业那他霉素生产菌株橘橙链霉GR-2中同样应用了此方法，成功构建了包含21个启动子和13个RBS的GEELs。随后，利用该库优化了那他霉素生物合成途径中的特异性转录激活因子基因sgnM的表达。结果表明，最优的工程菌株使他霉素产量提升了16.5%，达到1.97 g/L，进一步证明了该定制化GEEL构建策略在不同工业链霉菌中的有效性和通用性。

研究结论与重要意义

本研究成功建立了一套为工业链霉菌量身定制基因表达元件库的高效、低成本策略。该策略的核心创新在于结合了优化后的混合连接系统与单拷贝基因组整合/单轮接合技术，克服了传统方法在工业菌株中兼容性差、操作繁琐、依赖昂贵仪器等局限。

研究得出的结论是：在工业链霉菌中，直接套用模式菌株的遗传元件并不可靠，必须构建宿主特异的元件库。通过此策略构建的定制化GEELs，能够对pls、sgnM等关键代谢基因的表达进行精细调控，从而显著提高ε-聚-L-赖氨酸和他霉素的产量。更重要的是，该策略在两种不同的工业链霉菌中均验证成功，展示了其强大的通用性。

这项工作的意义重大。它不仅为工业链霉菌的代谢工程提供了一个强大且易于使用的基础工具包，使得研究人员能够像使用“调光开关”一样精确控制目标基因的表达强度，而且其构建策略本身——高效、低成本、不依赖特殊设备——极大地降低了相关研究的技术和资金门槛，有望在更多实验室推广。最终，这项研究为通过合成生物学手段理性设计并高效生产各种高价值的链霉菌源天然产物开辟了新的道路，对生物制造产业的可持续发展具有重要的推动作用。