在SIRT1抑制剂的作用下，欧莱欧皮林（Oleuropein）通过SIRT1/NRF2介导的氧化还原反应和代谢重编程，恢复了猪卵母细胞的受精能力

《Theriogenology》：Oleuropein restores oocyte competence during SIRT1 inhibition via SIRT1/NRF2-mediated redox and metabolic reprogramming in porcine oocytes

抑制SIRT1会损害猪卵母细胞成熟和胚胎发育，而橄榄苦苷（OLE）可通过激活SIRT1/NRF2通路改善氧化应激、线粒体功能和脂代谢，恢复发育能力，雷巴日醇（RES）具有类似效果。

　　

Nenghao Cao|Huilin Peng|Juntong Zhang|Yuhao Zhang|Siying Liang|Minghui Zhao|Yongnan Xu|Dongli Li|Yinghua Li

广东省大型动物生物医学模型重点实验室，华南大型动物生物医学模型研究所，五邑大学药学院与食品工程学院，中国江门529000

摘要：

Sirtuin 1（SIRT1）的抑制会损害猪卵母细胞的成熟和胚胎发育。在本研究中，我们探讨了橄榄素（OLE）是否能够恢复被SIRT1抑制剂EX527破坏的卵母细胞质量。EX527（1 μM）处理显著降低了SIRT1的表达，减少了第一极体的排出（对照组：74.0 ± 2.8% vs. EX527组：59.9 ± 1.1%，p < 0.001）、卵裂率、囊胚形成率（对照组：43.8 ± 5.4% vs. EX527组：30.4 ± 5.9%，p < 0.05）以及细胞数量。EX527还引发了氧化应激，表现为ROS水平升高和GSH含量下降、线粒体功能障碍（线粒体数量减少、ATP含量降低和膜电位下降）、脂质代谢紊乱（脂肪酸和脂滴减少），以及凋亡和自噬增加，这通过上调CB、BAX、ERK1、LC3β和P62的表达得到证实。同时使用OLE（5 μM）处理显著恢复了第一极体的排出（EX527组：59.4 ± 2.0% vs. EX527 + OLE组：69.7 ± 1.3%，p < 0.001）、卵裂率、囊胚形成率（EX527组：25.3 ± 2.4% vs. EX527 + OLE组：41.7 ± 6.0%，p < 0.01）和细胞数量。OLE重新激活了SIRT1/NRF2通路，改善了氧化还原平衡（上调CAT、SOD1和SOD2的表达），增强了线粒体生物发生（增加TFB1M和NRF1的表达），稳定了脂质代谢（上调PPARγ、ACACA和PLIN2），并减弱了异常的凋亡和自噬信号。SIRT1激活剂白藜芦醇（2 μM）也产生了类似的效果。综上所述，这些结果表明OLE通过SIRT1/NRF2通路减轻了SIRT1抑制的负面影响，促进了细胞质的成熟，暗示其在辅助生殖中的潜在应用。

引言

卵母细胞的质量是一个复杂的特征，受多种相互关联的因素影响，包括氧化应激、线粒体功能、脂质稳态、卵丘-卵母细胞通讯和细胞应激反应，所有这些因素都通过严格调控的生物网络进行协调[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。其中，氧化应激是决定卵母细胞能力的关键因素，因为过量的活性氧（ROS）会破坏纺锤体组装并损害线粒体功能[6]。在猪卵母细胞中，氧化应激和线粒体功能障碍密切相关。过量的活性氧（ROS）会抑制过氧化物酶体增殖激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）的表达和活性，而PGC-1α是线粒体生物发生和能量代谢的关键调节因子。PGC-1α活性降低会干扰线粒体基因（如TFAM和NRF1）的转录，导致线粒体复制受损、线粒体膜电位（MMP）降低和ATP生成减少[7]。相反，线粒体功能障碍会由于电子传递链活性低下而进一步促进ROS的积累，从而加剧氧化损伤，形成一个恶性循环，损害卵母细胞的品质和发育能力[8]。抗氧化剂如谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶1和2（SOD1和SOD2）有助于维持细胞稳态并保护卵母细胞的发育潜力[9]、[10]、[11]。因此，ROS水平、GSH含量以及CAT、SOD1和SOD2的活性常被用作评估卵母细胞氧化状态的指标。MMP、线粒体数量和ATP含量是衡量线粒体功能和生物能量能力的关键指标[12]。核呼吸因子1（NRF1）和转录因子B1（TFB1M）被广泛用于评估卵母细胞的线粒体质量和转录调控[13]、[14]。

氧化应激与猪卵母细胞中的脂质稳态密切相关。脂滴（LDs）是脂肪酸（FAs）的主要储存场所，反映了脂质的合成、储存和动员能力[15]。FAs是线粒体β-氧化和ATP生成的重要底物[16]。在氧化或代谢应激下，ROS水平升高和ATP耗竭会激活AMP-激活的蛋白激酶（AMPK），后者是细胞能量代谢的中心调节因子。激活的AMPK会抑制乙酰辅酶A羧化酶α（ACACA），减少丙二酰辅酶A的水平并促进线粒体脂肪酸的β-氧化以恢复能量平衡[17]。然而，持续的氧化应激会破坏AMPK信号通路和线粒体功能，降低β-氧化效率，导致脂滴异常积累[18]。过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）调节脂肪酸的合成和脂滴的形成，ACACA是脂肪酸生物合成中的限速酶，而perilipin 2（PLIN2）在脂滴稳定和脂质动员中起作用[19]、[20]、[21]。因此，FAs、脂滴以及PPARγ、ACACA和PLIN2是卵母细胞中脂质代谢的可靠指标。

此外，氧化应激通过氧化还原敏感的信号通路显著调节卵丘-卵母细胞通讯。ROS水平升高会激活卵丘细胞中的NF-κB信号通路，异常的NF-κB激活会损害间隙连接的完整性，从而影响代谢底物、抗氧化剂和调节信号向卵母细胞的传递[22]。这种破坏会导致线粒体功能障碍、ROS过度积累和发育能力下降。功能上，卵丘扩展指数（CEI）是衡量卵丘细胞活性和细胞外基质重塑的敏感指标[23]。同时，五肽素3（PTX3）是一种主要由NF-κB信号通路调节的卵丘分泌蛋白，在基质稳定和卵丘-卵母细胞通讯中起关键作用[24]。因此，CEI和PTX3的表达水平可以作为卵丘-卵母细胞通讯的可靠标志物。

氧化应激在猪卵母细胞中作为细胞应激反应的关键上游调节因子，主要通过ROS敏感的AMPK–mTOR信号通路发挥作用。在体外成熟过程中，ROS过度积累和线粒体功能障碍会破坏能量稳态，激活AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）。激活的AMPK会抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路，从而促进自噬作为对代谢和氧化应激的适应性反应[25]。这一过程的特点是自噬相关标志物（如LC3β、ATG5和p62）的变化[26]。同时，ROS水平升高和线粒体膜电位（ΔΨm）的去极化会激活凋亡通路。ROS诱导的线粒体损伤会促进BAX向线粒体外膜的转运，触发细胞色素c的释放和随后的caspase-3激活[27]。Cathepsin B（CB）的活性是早期凋亡损伤的标志物，而caspase-3、BAX和ERK1信号通路代表关键的凋亡事件[28]、[29]、[30]、[31]。尽管适度的自噬可能通过清除受损的细胞器发挥细胞保护作用，但持续的氧化应激和长期的AMPK–mTOR失衡会使细胞反应从适应性自噬转向凋亡和细胞死亡。

Sirtuin 1（SIRT1）和核因子红细胞2相关因子2（NRF2）被认为是多种细胞类型中氧化防御和线粒体完整性的关键调节因子。SIRT1是一种NAD⁺依赖的去乙酰化酶，通过调节与NRF2和FOXO相关的转录调节因子来增强抗氧化能力，从而促进抗氧化酶的表达[32]。此外，SIRT1通过去乙酰化PGC-1α来调节线粒体生物发生和功能，支持氧化磷酸化和ATP生成[33]。NRF2作为细胞抗氧化反应的主要转录调节因子，在氧化应激下，NRF2与其细胞质抑制剂KEAP1分离，转移到细胞核中，并与抗氧化反应元件（ARE）结合，诱导HO-1、NQO1、SOD和GSH相关酶的表达[34]。除了氧化还原调节外，NRF2还通过保持线粒体完整性、减少线粒体DNA的氧化损伤以及调节线粒体动态和代谢适应来保护线粒体[35]。总体而言，SIRT1–NRF2通路在协调氧化还原平衡和线粒体保护方面起着关键作用，从而对维持细胞质量至关重要。

橄榄素（OLE）已在多种细胞模型中显示出强大的抗氧化、抗炎和线粒体保护作用。例如，在人类胶质母细胞U87细胞中，OLE预处理可以减轻H₂O₂引起的氧化应激，恢复谷胱甘肽水平，并降低活性氧和氧化能力，证明了其在神经细胞中的抗氧化潜力[36]。在用脂多糖（LPS）刺激的BV-2小胶质细胞中，OLE抑制了促炎介质并抑制了ERK / p38/NF-κB信号通路，显示出显著的抗炎活性[37]。此外，在人类骨骼肌细胞（AB1079）中，OLE减少了氧化损伤并激活了AMPK/FOXO3a相关通路，支持其在保护线粒体功能和细胞能量稳态中的作用[38]。白藜芦醇（RES）是一种公认的SIRT1激活剂，已被广泛报道可以改善猪卵母细胞的体外成熟（IVM）和早期胚胎发育[39]、[40]。因此，本研究中使用RES作为阳性对照。

尽管有越来越多的证据表明OLE具有益处以及SIRT1在维持卵母细胞质量中的核心作用，但尚不清楚在SIRT1功能障碍的情况下OLE是否仍能发挥保护作用。鉴于OLE在氧化还原调节和线粒体保护中的已知作用，以及SIRT1和NRF2之间的功能相互作用，我们假设OLE可能通过调节SIRT1/NRF2通路来缓解SIRT1抑制引起的卵母细胞损伤。本研究的目的是系统地探讨OLE是否能在SIRT1功能障碍的情况下恢复卵母细胞的发育能力，并阐明其保护作用的信号传导层次和下游细胞过程。本研究的结果可能为提高猪的繁殖效率提供理论基础，并为生殖年龄较大或暴露于环境压力的动物提供提高卵母细胞质量的潜在策略，最终有助于改善受精结果和早期胚胎发育。

部分内容摘要

伦理声明

卵母细胞来自中国广东省江门市一家屠宰场的未绝经的兰德瑞斯×大白杂交母猪。由于本研究不涉及活体动物，因此不需要额外的伦理批准，消除了潜在的伦理冲突。

化学物质和试剂

除非另有说明，所有化学物质和试剂均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。EX527、OLE和RES购自MedChemExpress（蒙茅斯）

EX527介导的SIRT1抑制会破坏氧化还原稳态，损害猪卵母细胞的成熟和早期胚胎发育

通过用不同浓度（0.1–10 μM）的选择性SIRT1抑制剂EX527处理卵母细胞来评估其成熟情况。免疫荧光（IF）分析显示，所有EX527处理组的SIRT1信号强度均显著低于对照组。值得注意的是，即使是最低剂量（0.1 μM）也显著降低了SIRT1信号强度（对照组：1.00 ± 0.10 vs. EX527组：0.95 ± 0.13，p < 0.01 vs. 1 μM EX527组：0.86 ± 0.12，p < 0.001 vs. 10 μM EX527组：

讨论

橄榄油中最丰富的酚类生物活性化合物OLE已被广泛报道在多种细胞类型中具有抗氧化、保护线粒体和抗凋亡作用[44]、[45]。然而，在卵母细胞这种高度特化的细胞类型中——其依赖于紧密协调的代谢调节和线粒体稳态——OLE的作用机制及其通过特定信号通路的介导程度仍不甚清楚

结论

总之，我们证明了SIRT1的藥理抑制会严重损害猪卵母细胞的成熟和早期胚胎发育，而橄榄素的补充有效恢复了这种损伤。这种保护作用是通过重新激活SIRT1/NRF2信号通路来实现的，从而协调改善了氧化还原稳态、线粒体功能、脂质代谢和发育能力。我们的发现表明橄榄素是一种有前景的天然

日期

本研究生成或分析的所有日期均包含在本文及其补充信息文件中。

CRediT作者贡献声明

Yongnan Xu：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取。Dongli Li：监督、资源管理。Siying Liang：正式分析、数据管理。Minghui Zhao：监督、资源管理。Yinghua Li：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取。Juntong Zhang：监督、正式分析、数据管理。Yuhao Zhang：正式分析、数据管理。Nenghao Cao：撰写 – 初稿、方法学、实验设计。

资金

本研究得到了广东省科学技术厅的科技规划项目（项目编号2021B1212040016）和山东省青创研究团队（农场动物克隆创新团队，012-1622001）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。