VGLL4通过Wnt/β-连环蛋白通路促进肝细胞癌的进展

《Tissue and Cell》：VGLL4 promotes hepatocellular carcinoma progression via the Wnt/β-catenin pathway

肝细胞癌（HCC）预后差，本研究通过TCGA队列分析（355例HCC，43例对照）及体外/体内实验，发现VGLL4表达显著升高，与TNM分期正相关，并独立预测患者预后不良。机制上，VGLL4激活Wnt/β-catenin通路（上调β-catenin、TCF4、c-Myc），诱导上皮-间质转化（↑vimentin、N-cadherin）及肿瘤干性（球体形成），同时与CAFs、MDSCs、巨噬细胞、内皮细胞浸润正相关。因此，VGLL4驱动HCC进展，可作为预后标志物及治疗靶点。

　　

王高雄|陈志伟|潘娟勇

福建医科大学第二临床医学院，中国福建省泉州市

摘要

由于诊断不及时和治疗方法有限，肝细胞癌（HCC）的预后较差。本研究旨在阐明VGLL4在HCC进展中的作用及其机制。我们分析了来自The Cancer Genome Atlas（TCGA）队列的355名HCC患者和43名非肿瘤对照者的RNA-seq数据及临床信息，并进行了体外和体内实验。TCGA分析显示，与正常组织相比，HCC肿瘤中VGLL4的表达显著上调，其表达水平随TNM分期的增加而升高，且与性别和年龄无关。高水平的VGLL4表达独立预测了更短的总体生存期和无进展生存期（与不良预后相关），并具有诊断价值。在体外实验中，HuH-7 HCC细胞中过表达VGLL4可增加细胞增殖（通过CCK-8检测）、迁移能力（伤口愈合实验）、侵袭性（Transwell实验）和干性（肿瘤球形成实验）。在体内实验中，将过表达VGLL4的HuH-7细胞（4×10?细胞接种到4周大的雄性BALB/c裸鼠体内并观察8周）皮下移植后，这些细胞的肿瘤体积和重量均大于对照组。从机制上看，VGLL4激活了Wnt/β-连环蛋白通路（上调核β-连环蛋白、TCF4和c-Myc），诱导上皮-间质转化（EMT，上调vimentin和N-钙粘蛋白），并在TCGA队列中与癌相关纤维细胞（CAFs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）、巨噬细胞和内皮细胞的浸润呈正相关。因此，VGLL4通过Wnt/β-连环蛋白通路连接肿瘤内在的EMT/干性程序和基质相互作用，推动HCC的进展，可作为预后生物标志物和潜在的治疗靶点。

引言

2020年，原发性肝癌在全球癌症发病率中排名第七，是癌症相关死亡的第三大原因，估计新发病例数为905,677例，死亡数为830,180例（Sung等人，2021年）。肝细胞癌（HCC）占原发性肝癌病例的75%-85%，其次是肝内胆管癌（10%-15%）和其他罕见亚型。尽管针对HCC的治疗方法有所进展，但其生存率仍然很低，5年生存率仅为21%（Siegel等人，2022年）。诊断延迟以及缺乏针对晚期患者的有效治疗方法是导致这一不良预后的主要原因。HCC的发病机制涉及多个基因之间的复杂相互作用（Chidambaranathan-Reghupaty等人，2021年），这为开发针对晚期的靶向治疗带来了巨大挑战。因此，迫切需要寻找新的诊断生物标志物并开发有效的HCC治疗方法。

VGLL蛋白是一类新的TEAD相互作用共伴侣蛋白，在肿瘤发生和肿瘤进展中起关键作用。其中，VGLL4因其TDU（Tondu）结构域而具有独特性，这使其与其他VGLL家族成员区分开来（Yamaguchi，2020年）。研究表明，VGLL4对多种癌症类型（如胃癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌）具有抑制作用（Jiao等人，2014年；Zhang等人，2014年；Jiao等人，2017年；Zhang等人，2017年）。然而，Wu等人的研究结果则相反，他们认为下调VGLL4可以抑制肿瘤PD-L1表达并减少免疫逃逸，且较低的VGLL4表达水平与人类癌症的改善临床结果相关（Wu等人，2019年）。

目前关于VGLL4在HCC中的作用的研究较少，现有发现也存在矛盾（Xie等人，2018年；Guo等人，2019年；Shu等人，2018年；Joo等人，2020年；Li等人，2019年）。因此，阐明VGLL4对HCC的影响具有重要意义。生物信息学分析被广泛用于研究基因在特定肿瘤中的作用。通过利用TCGA中的HCC数据并进行实验验证，我们旨在明确VGLL4在HCC中的功能，为未来的研究提供见解。

部分内容

RNA测序数据和样本

我们从TCGA数据库中检索了HCC队列（RRID:SCR_003193），排除了有其他肿瘤病史的个体。最终获得了一个包含355名HCC患者和43名对照组的数据集，其中包括RNA-seq-V2数据集及相关临床信息。

细胞培养和转染

人类HCC细胞系HuH-7（RRID:CVCL_0462）于2022年6月从Procell Life Science & Technology Co., Ltd.获得。2023年5月，在泉州高品医学中心使用短串联重复序列分析验证了HuH-7细胞的真实性。

VGLL4在HCC中高表达

在TCGA队列中，HCC肿瘤组织中的VGLL4表达水平显著高于正常组织（图1A）。即使在同一队列的配对样本中，这一结果也是一致的（图1B）。进一步根据TNM分类进行分组后，发现I/II期患者的表达水平与III/IV期患者存在差异，所有分期的表达水平均显著高于正常组织（图1C）。

讨论

本研究探讨了VGLL4在HCC中的作用，并强调了其作为诊断生物标志物和治疗靶点的潜力。研究结果表明，HCC肿瘤组织中的VGLL4表达水平高于正常组织，高表达与不良预后相关。VGLL4已被确定为一种不良的、独立的预后因素，突显了其临床重要性。

与作为HCC中常见的驱动基因不同，VGLL4更像是作为表型修饰因子发挥作用。

致谢

本研究由福建医科大学的启航项目（2022QH1632）和华侨大学医学院的创新项目（2021YX002）资助。

伦理声明

研究方案的批准：涉及动物的研究已获得福建医科大学实验动物伦理委员会（IACUC FJMU 2024-Y-1211）的审查和批准。

CRediT作者贡献声明

陈志伟：软件、资源、方法学、实验设计、数据分析、数据管理。王高雄：撰写初稿、软件使用、项目管理、方法学设计、实验设计、资金获取、数据分析、概念构思。潘娟勇：撰写修订稿、数据可视化、结果验证、实验监督、软件使用、方法学设计、资金获取、概念构思。

利益冲突披露

无。

致谢

本研究由福建医科大学的启航项目（2022QH1632）和华侨大学医学院的创新项目（2021YX002）资助。

利益冲突声明

作者声明没有潜在的利益冲突。