《Tissue and Cell》：M2 Macrophage-Derived Migrasomes Enhance Bone Regeneration by Directing Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells (BMSCs)
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M2巨噬细胞迁移体通过上调BMP-2、RUNX2等基因及蛋白表达促进骨折愈合中骨髓间充质干细胞的成骨分化。
王梦慈|张思雨|阿布杜雷希提·库蒂比丁|周晓丹|田晓涵|袁顺强|吕梦娇|杨毅|白生斌
新疆医科大学基础医学学院组织学与胚胎学系，中国新疆维吾尔自治区830000
摘要
目的
虽然M2型巨噬细胞介导的免疫调节对骨骼再生至关重要，但新发现的一种细胞器——迁移小体（migrasomes）的作用尚未被探索。本研究旨在探讨M2型巨噬细胞衍生的迁移小体对骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化的作用。
方法
使用IL-4将巨噬细胞极化为M2表型。随后通过电子显微镜和Western blotting（WB）技术分离并鉴定迁移小体。在体内实验中，用100 μg/mL的M2型巨噬细胞衍生的迁移小体处理小鼠股骨骨折模型，并通过X射线、微计算机断层扫描（microCT）和免疫荧光技术分析骨折愈合情况。在体外实验中，将骨髓间充质干细胞（BMSCs）与60 ng/mL的迁移小体共培养。在24小时后通过伤口愈合实验评估细胞迁移情况；在72小时后通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）和WB检测RUNX2、ALP、OCN和Bmp-2的表达；分别在14天和21天通过ALP和阿利扎林红S（ARS）染色评估成骨活性。
结果
Arg-1和CD206表达的增加证实了M2型巨噬细胞的成功诱导（P < 0.01, P < 0.0001）。透射电子显微镜和Western blotting（WB）验证了M2型巨噬细胞衍生的迁移小体的成功分离和纯化。X射线和微计算机断层扫描分析显示，迁移小体处理显著促进了骨折愈合。qRT-PCR显示迁移小体有效上调了BMSCs中BMP-2、RUNX2、ALP和OCN的mRNA水平（P < 0.05, P < 0.01）；WB显示M2型巨噬细胞衍生的迁移小体处理组中成骨标志物（BMP-2、RUNX2、ALP）的蛋白质水平升高（P < 0.05）。
结论
M2型巨噬细胞衍生的迁移小体通过促进BMSCs的成骨分化来促进骨折愈合。
引言
骨折后的骨骼愈合是一个极其复杂的生物过程。大约5%到10%的患者会出现骨折愈合延迟（Jamal等人，2022年），其主要原因是骨骼的免疫调节功能异常。当骨折修复开始时，免疫细胞首先迁移到损伤部位清除碎片和坏死细胞，随后骨髓间充质干细胞（BMSCs）被招募并分化为成骨细胞，从而驱动新骨基质的形成和血管生成（Loi等人，2016年）。BMSCs在骨折部位形成的软骨痂在2到6周内逐渐矿化，以确保局部机械稳定性（Einhorn和Gerstenfeld，2015年）。在这个过程中，BMSCs（Torrecillas-Baena等人，2023年）、成骨细胞（Zhang等人，2023a）、破骨细胞（郑苗苗，2024年）、骨细胞和免疫细胞（Chan等人，2021年）之间存在精确的细胞通信网络。揭示这些细胞相互作用的机制是推进骨骼再生研究的关键。
骨折引发的炎症微环境是骨髓基质细胞（BMSCs）成骨分化的必要前提，而巨噬细胞在此阶段起着核心作用（Zhao等人，2020年）。参与组织修复的M2型巨噬细胞通过旁分泌信号传导促进骨骼修复，但它们在损伤部位的短暂停留严重限制了其治疗潜力（Chen等人，2019年）。最近的研究证实，M2型巨噬细胞与BMSCs之间的细胞间通信是骨骼修复的关键调节环节，而细胞外囊泡（EVs）作为这种通信的重要媒介受到了广泛关注（Fan等人，2023年）。
值得注意的是，在巨噬细胞迁移到损伤部位的过程中，它们可能会释放一些尚未完全理解的功能性物质。迁移小体是一种特定于迁移细胞的新型细胞器（直径为0.5-3 μm，包含多个内部囊泡），是在细胞迁移过程中在收缩纤维顶部或分支处形成的膜结构（Ma等人，2015年）。先前的研究表明，迁移小体可以作为细胞间物质和信号传递的关键载体，参与各种生理和病理过程（Jiang等人，2023年）。我们的初步研究发现，迁移小体在促进间充质干细胞（MSC）归巢方面的效果明显优于外泌体，这促使我们思考：M2型巨噬细胞在迁移到骨折部位过程中产生的迁移小体是否通过调节BMSCs的成骨分化来参与骨骼修复？
本研究证实M2型巨噬细胞可以分泌迁移小体，这些迁移小体能够调节BMSCs的成骨分化（图1）。同时，我们也推测M2型巨噬细胞衍生的迁移小体是否包裹了特定的成骨因子，这些因子可以通过直接信号传递诱导BMSCs分化为成骨细胞，从而加速骨折愈合。
实验细胞
骨髓间充质干细胞（BMSCs，Procell，产品编号：CP-M131）和RAW264.7细胞（SaiBaikang，产品编号：iCell-m047）。
实验动物
所有动物实验均获得新疆医科大学第一附属医院实验动物伦理委员会的批准（批准编号：[20210301-33]），并严格遵循中国国家卫生健康委员会的相关指南。从实验动物中心购买了体重为20±2克的雄性C57/BL6小鼠
体外诱导M2型巨噬细胞极化及迁移小体的分离
为了研究M2型巨噬细胞衍生的迁移小体对骨髓间充质干细胞（BMSCs）的调节机制，将RAW264.7细胞在含有50 ng/ml IL-4的培养基中培养24小时。倒置显微镜观察显示细胞呈纺锤形，这与M2型巨噬细胞的典型形态一致（图2A）。流式细胞术分析显示CD206表达显著增加（图2B）。qRT-PCR结果证实Arg-1和CD206的mRNA水平显著升高
讨论
骨折愈合是一个高度协调的生物过程，其中早期无菌炎症微环境的调节至关重要。先前的研究已经证实，骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化与巨噬细胞的极化状态之间存在密切相互作用（Kang等人，2020年）。分析这种细胞间对话的分子机制对于优化临床骨骼修复具有重要的指导价值
伦理批准和参与同意
所有动物实验均获得新疆医科大学第一附属医院动物伦理委员会的批准（编号：20210301-33），并按照ARRIVE指南进行。
数据和材料的可用性
本研究中生成和/或分析的数据集可应合理要求向通讯作者索取。资助
本项目得到了中央亚高发疾病病因与预防国家重点实验室与省级部门联合开展的专项项目的支持（SKL-HIDCA-2024-GX8）。CRediT作者贡献声明
田晓涵：软件、方法学、实验设计。周晓丹：验证、方法学、数据分析。吕梦娇：验证、方法学。袁顺强：软件、方法学、数据管理。杨毅：撰写 – 审稿与编辑、验证、资金筹集。白生斌：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理。张思雨：监督、方法学、数据管理。王梦慈：撰写 – 初稿撰写、验证、方法学、数据分析。
