《Toxicology Reports》：Comparative toxicity of menthol- and tobacco-flavored electronic cigarette constituents inducing inflammation, epithelial barrier dysfunction, and nicotinic acetylcholine receptor modulation in the absence of nicotine.
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随着电子烟（ENDS）使用的日益普及，薄荷和烟草味产品作为可燃卷烟的“更安全”替代品被广泛使用。然而，其中多种非尼古丁成分的潜在肺毒性尚不明确。本研究通过体外模型，探究了丙二醇/植物甘油（PG/VG）、苯甲酸、乙偶姻、L-薄荷酮、WS-23等常见风味成分对人类支气管上皮细胞的影响。结果发现，这些成分能导致上皮屏障功能受损，引发IL-6和IL-8等炎症因子升高，并调控烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）的表达。这表明，即使不含尼古丁，电子烟中的某些风味成分也可能通过类似尼古丁的信号通路诱导肺损伤和炎症，为评估电子烟安全性提供了重要的机制性见解。
在过去的几十年里，电子尼古丁传送系统（ENDS），俗称电子烟，的使用量显著增加。它们常被宣传为戒烟的辅助工具或传统卷烟的安全替代品。然而，一个不容忽视的趋势是，电子烟在非吸烟的青少年和年轻人中变得越来越流行。据统计，2023年美国中学生中电子烟的使用率高达7.7%，约213万学生，其中近九成使用者选择风味产品。而在众多口味中，薄荷和烟草味在成年使用者中尤为普遍。这种流行部分源于2020年美国食品药品监督管理局（FDA）的一项禁令，该禁令除了薄荷和烟草味外，禁止了封闭式烟弹中大多数其他风味，这无意中推动了这两种风味产品的使用。薄荷因其吸入时的清凉感和镇咳特性而备受欢迎，能降低使用时的刺激性，从而可能增加使用频率和尼古丁摄入量。
尽管电子烟被标榜为“减害”产品，但越来越多的证据表明，其可能对肺部健康构成独特威胁。传统烟草引发的慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘等疾病，已知与烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）的介导有关。尼古丁通过与这些受体结合，介导肺损伤和成瘾性。然而，电子烟液体（E-liquid）是一个复杂的化学混合物，除了尼古丁，还含有丙二醇/植物甘油（PG/VG）等溶剂以及各种风味添加剂。目前，人们对于这些非尼古丁成分，特别是薄荷和烟草风味中常见的化学成分，是否以及如何影响肺部健康，尤其是它们是否会干扰与肺病相关的nAChR通路，知之甚少。这就构成了一个关键的知识空白：电子烟的风味成分，在完全不含尼古丁的情况下，是否足以引发肺损伤？
为了回答这个问题，来自普渡大学健康科学学院的研究团队进行了一项深入的体外研究。他们的核心假设是：暴露于烟草和薄荷味电子烟中的常见成分，可以通过调控烟碱乙酰胆碱受体（α-nAChRs），引发肺损伤反应。这项研究旨在比较这些风味成分的毒性，并探究其潜在的致病机制，相关成果发表在了《Toxicology Reports》期刊上。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了几项关键技术：首先，他们使用了人支气管上皮细胞系（BEAS-2B），并将其培养在具有气-液界面（ALI）的Transwell小室中，以更好地模拟呼吸道屏障。其次，通过跨上皮电阻（TEER）和电压（mV）测量来定量评估上皮屏障的完整性。第三，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中的炎症因子白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）的水平。第四，使用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）染色并通过自动细胞计数器评估细胞毒性。最后，通过蛋白质免疫印迹（Western Blot）技术，定量分析了几种关键的nAChR亚型（α1, α4, α5, α7）的蛋白表达量。所有实验均设置了严格的对照，并遵循了可重复的科研标准。
研究结果
3.1. 烟草和薄荷ENDS风味化学成分导致上皮屏障功能障碍
所有测试的成分——L-薄荷酮、98%薄荷酮、香芹酮、WS-23、香兰素、苯甲酸和PG/VG，与未处理对照组相比，都导致了上皮屏障完整性的下降。具体而言，乙偶姻、香兰素、WS-23和PG/VG引起了跨上皮电阻（TEER）和电压（mV）的显著降低，表明这些化学成分破坏了细胞间的紧密连接。而L-薄荷酮、98%薄荷酮和香芹酮则主要引起了电压的严重下降，这提示即使紧密连接结构尚未明显破损，上皮细胞的极性、代谢和离子转运功能已受到不利影响。苯甲酸处理则在多个时间点同时降低了电阻和电压。
3.2. ENDS成分在支气管上皮细胞中引发炎症反应
为了评估炎症反应，研究人员测量了细胞培养上清中炎症介质的水平。结果显示，PG/VG、香芹酮和WS-23处理组的细胞，其白细胞介素-6（IL-6）水平显著升高。此外，98%薄荷酮和香芹酮处理还显著提升了另一种重要的促炎因子白细胞介素-8（IL-8）的水平。这些细胞因子的升高意味着肺部可能启动了固有的炎症应答。
3.3. 细胞毒性评估
在测试的浓度（100 μM）下，除了98%薄荷酮引起了约19%的细胞死亡（具有统计学意义）外，其他大多数成分（如PG/VG、苯甲酸、香芹酮、WS-23、香兰素、乙偶姻）引起的细胞毒性微乎其微（低于10%）。这表明，观察到的屏障功能障碍和炎症反应并非由大范围的细胞死亡直接造成，而是这些化学成分对细胞功能的特异性干扰。
3.4. 非尼古丁风味化学成分增加支气管上皮细胞中的烟碱乙酰胆碱受体
这是本研究最关键的发现之一。蛋白质免疫印迹分析显示，用PG/VG、乙偶姻、香芹酮和WS-23处理的细胞，其几种nAChR亚型的蛋白丰度发生了变化。其中，乙偶姻和PG/VG处理显著增加了CHRNA5（α5亚基）的表达。WS-23处理则显著增加了CHRNA7（α7亚基）的表达。同时，CHRNA1（α1亚基）和CHRNA4（α4亚基）也受到PG/VG、乙偶姻、香芹酮和WS-23的影响而呈现上升趋势。这些数据表明，即使在没有尼古丁的情况下，这些电子烟风味成分也能调控nAChR的表达，尤其是α5和α7亚基。
结论与讨论
本研究的发现有力地支持了其初始假设。研究表明，薄荷和烟草味电子烟中常见的非尼古丁成分，能够独立地引起肺上皮屏障功能的障碍，诱发炎症反应（表现为IL-6和IL-8升高），并调控烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）的表达谱。这意味着，电子烟的潜在危害可能不仅仅来源于尼古丁，其风味添加剂本身就能通过类似于尼古丁的受体通路，参与肺损伤的早期进程。
在讨论中，作者将他们的发现与现有研究进行了联系和对比。例如，乙偶姻作为丁二酮的前体，其潜在风险与已知的“爆米花肺”（闭塞性细支气管炎）相关联。苯甲酸常用于尼古丁盐配方，本研究证实了其破坏屏障功能的作用。PG/VG作为溶剂，也被发现能单独引发炎症。特别值得注意的是合成冷却剂WS-23，它表现出与天然薄荷醇类似物相近的毒性，能引起屏障功能障碍、IL-6升高和CHRNA7增加，这提示所谓“冰感”产品可能具有与薄荷添加剂相似的肺毒性风险。
最重要的是，nAChR表达的调控为理解风味成分的致病机制提供了新视角。α7受体通路已知在COPD的气道重塑和阻塞中发挥作用，而α5和α7亚基也涉及多种与代谢、增殖和炎症相关的细胞信号通路（如JAK/STAT, ERK1/2, PI3K/Akt）。本研究发现风味成分能上调这些受体，暗示它们可能使肺部细胞对损伤更敏感，或直接激活与炎症和疾病发展相关的下游通路。
当然，作者也指出了本研究的局限性，例如使用的是永生化细胞系而非完全分化的原代细胞，缺乏体内环境的复杂性和代谢转化等。因此，这些结果主要作为危害识别和机制探讨，而非直接预测人体疾病结局。
尽管如此，这项研究的意义重大。它首次系统地比较了多种常见电子烟风味成分在无尼古丁条件下的直接肺上皮毒性，并创新性地将其与nAChR调控机制联系起来。研究结果挑战了“电子烟危害仅源于尼古丁”的简单认知，强调了对电子烟各种成分进行独立、严格毒理学评估的必要性。这些发现为公共卫生监管机构提供了科学依据，提示在制定电子烟监管政策时，不仅需要关注尼古丁含量，也必须严格审视和限制其中风味添加剂的种类与浓度，以期为公众健康构筑更全面的保护屏障。
