综述：面向精准医疗的基于微流控技术的电动汽车相关microRNA检测平台：挑战、策略与前景

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Precision Medicine-oriented EV-microRNA Detection Platforms on Microfluidics: Challenges, Strategies, and Perspectives

外泌体miRNA作为非侵入性生物标志物在精准医学中潜力巨大，但传统检测流程繁琐且存在灵敏度低、特异性不足等问题。本文系统综述微流控技术在EV分离、探针递送及miRNA检测全流程的整合应用，提出通过优化微通道表面修饰、实现原位检测和多重联用提升临床转化价值。

王梦曦|修乐山|胡琴琴|尹坤

上海交通大学医学院中国热带病研究中心全球健康学院，中国上海重庆南路227号，200025

摘要

细胞外囊泡（EVs）是携带多种生物活性分子的细胞来源的纳米颗粒。其中，源自EV的微小RNA（EV-miRNAs）能够调节母细胞的生理和病理状态以及细胞间通讯，使其成为精准医疗中具有前景的无创生物标志物。然而，EV-miRNA的检测涉及多个步骤，包括EV分离、裂解和RNA提取，这些步骤共同影响了检测的稳健性和临床应用。微流控技术为高分辨率的EV分离和从微量生物流体中检测miRNAs提供了强大的工具。尽管如此，现有的综述通常仅单独讨论这一过程的各个组成部分，并对整个EV-miRNA检测工作流程的最新进展进行有限的探讨。在这篇综述中，我们提供了一个综合性的EV-miRNA检测策略概述，重点介绍了包含EV分离、EV裂解或原位探针递送以及完全集成的miRNA检测平台的微流控工作流程。我们还进一步讨论了当前面临的挑战以及开发可靠且可临床应用的EV-miRNA检测平台的发展方向。

引言

细胞外囊泡（EVs）是由真核细胞和原核细胞分泌的脂质双层包裹的颗粒，广泛分布于血液、尿液、母乳和脑脊液等多种生物流体中[1]，[2]。根据其生成方式和大小，EVs被分为三种亚型：源自多囊泡体与质膜融合的外泌体（30-150纳米），通过质膜出芽产生的微囊泡（100-1000纳米），以及在程序性细胞死亡过程中释放的凋亡小体（1-5微米）[3]，[4]。作为细胞间通讯的动态介质，EVs能够将母细胞衍生的生物分子（如脂质、蛋白质和核酸）运输穿过生理屏障，保护它们免受体液中的酶促降解，并稳定循环以调节远端细胞功能[5]，[6]，[7]，[8]。

在EV的载荷中，微小RNA（miRNAs）是约22个核苷酸长的非编码RNA，1993年首次在秀丽隐杆线虫中发现，它们在EV介导的细胞间调节中起着关键作用[9]。miRNAs的生物生成过程始于核内初级转录本（pri-miRNAs）在RNA聚合酶II依赖下的转录，随后由Drosha-DGCR8复合体处理成前体miRNAs（pre-miRNAs）[9]，[10]。pre-miRNAs通过Exportin-5转运到细胞质中，并被Dicer酶切割成双链。其中一条链随后被加载到RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的Argonaute蛋白上，从而在转录后水平调节目标mRNAs[11]。功能上，miRNAs调节超过60%的人类蛋白质编码基因[12]，调控细胞增殖、凋亡[13]，[14]和免疫反应[15]等关键过程，其失调与癌症[16]，[17]、神经退行性疾病[18]，[19]和心血管疾病[20]有关。例如，在原发性肿瘤来源的细胞外囊泡（pTDEs）中富集的miR-1会诱导细胞内活性氧（ROS）的产生和DNA损伤，导致细胞周期停滞，最终限制远处转移的生长，显示出作为潜在抗转移剂的潜力[21]。关于心血管疾病的研究表明，特定的miRNAs（如miR-133a、miR-208、miR-499和miR-1）在心肌细胞和骨骼肌细胞中富集。miRNA特征的改变是心肌梗死的不良诱因；例如，miR-23a、miR-23b、miR-24和miR-214的上调会促进心肌细胞肥大，而由α-肌球蛋白重链启动子驱动的miR-195过表达会导致小鼠出生后两周内的心脏衰竭和死亡[22]。另一项多中心临床队列研究还显示，在α-突触核蛋白病中，血浆中含miR-44438的EV水平升高，提示其与帕金森病（PD）和多系统萎缩症（MSA）的进展可能有关[23]。此外，大量研究表明miR-21可以靶向肿瘤抑制基因如PTEN和PDCD4，其在血清中的循环表达水平在胃癌、结直肠癌和胶质母细胞瘤等多种癌症中显著升高，是癌症发生和进展的重要生物标志物[24]。这种miRNA介导的基因调控和系统递送的结合使EV-miRNAs成为无创诊断、实时疾病监测和预后评估的强大循环生物标志物[25]，[26]，[27]。

目前的EV-miRNA检测依赖于高纯度和高回收率的EV分离以及超灵敏的miRNA分析。对于EV分离，金标准超速离心（UC）在长时间离心过程中会产生囊泡剪切应力，导致EV膜受损并导致miRNA泄漏[28]。替代方法如尺寸排阻色谱（SEC）或基于聚合物的沉淀法操作较为简单，但纯度不足，因为共分离的污染物（如脂蛋白、蛋白质聚集体）会干扰后续分析[29]。此外，大多数分离技术需要专门的设备和专业知识，限制了其临床实用性（表1）[30]。对于miRNA检测，EV-miRNAs的丰度较低且与相关异构体序列高度相似，因此需要超灵敏和特异的方法。常用的方法包括逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和下一代测序（NGS），虽然能够实现超灵敏的检测并提供全面的谱型分析，但成本高昂且操作繁琐[31]，[32]，[33]（表2）。这些限制凸显了迫切需要创新策略来简化EV-miRNA分析，以促进其临床应用。

微流控技术作为一种变革性方法出现，为EV-miRNA分析提供了集成解决方案。通过将EV分离、富集和miRNA检测整合到一个平台上，微流控技术能够精确操控微量液体体积（10^-9至10^-18升），具有高时空可控性，显著减少了处理时间和污染风险[34]。其微型化设计和自动化工作流程不仅提高了灵敏度和重复性，也符合即时检测（POCT）的要求[35]。迄今为止，先进的微流控设备在从复杂生物流体中分离EVs方面表现出优异的效率，通过利用EVs的物理特性（如大小、密度）或表面标记物实现了更高的纯度。此外，微流控技术还实现了核酸扩增和纳米生物传感器的芯片集成，从而能够超灵敏地检测低丰度的EV-miRNAs[36]，[37]。最新研究还表明，EV分离和EV-miRNA检测可以在同一微流控平台上同时完成[38]，[39]。

之前的综述提供了关于EV研究特定方面的宝贵见解（表3），包括它们的功能机制[40]、与疾病相关的生物医学应用[41]，[42]，以及EV分离和分析技术[43]，[44]。然而，目前仍缺乏讨论基于微流控技术的EV-miRNA检测最新进展的综述。我们的综述填补了这一空白，围绕“挑战-策略-展望”这一核心主题，系统地涵盖了整个EV-miRNA工作流程中的新兴微流控策略。与分别关注EV分离、外泌体核酸和微流控技术的综述不同，我们全面考察了EV分离、探针递送、miRNA检测和信号读取的整个工作流程及其多维挑战。然后，我们讨论了将多个甚至所有上述步骤整合到单个平台中的先进微流控架构，以促进精准医疗的集成分析，强调了诸如原位检测等克服先前技术限制的创新（图1）。除了列举技术外，这篇综述还概述了未来研究的潜在方向，旨在帮助研究人员充分利用EV-miRNA生物标志物在精准诊断和治疗监测中的潜力。通过识别关键瓶颈，它为开发更高效、灵敏和可靠的EV-miRNA检测平台提供了路线图，为基础研究、技术开发和临床应用提供了实用指导。

章节摘录

挑战

理想的EV-miRNA检测方法应在保持高灵敏度和特异性的同时实现高通量分析，以满足临床诊断和大规模研究的需求。此外，由于EV-miRNAs作为无创生物标志物，标准化检测协议对于确保不同实验室和操作者之间结果的高度重复性至关重要，这是临床应用的前提条件。

然而，开发这样的理想

基于标签的微流控分离系统

基于标签的EV分离技术利用EV表面标记物（如蛋白质和脂质）与相应亲和分子之间的特异性相互作用[95]。微流控系统通过用亲和元件（如抗体、适配体或脂质结合蛋白）修饰微通道表面来促进选择性EV捕获[96]，从而实现高效的受体-配体相互作用（图3A）。与传统分离方法相比，微流控平台提供了精确的流体控制，

EV-miRNA检测技术

由于EV-miRNAs受到磷脂双层的保护，因此需要裂解EV颗粒以提取miRNA进行分析。最近专注于合理设计的探针递送系统的进展展示了原位检测EV-miRNAs的潜力。作为一种集成解决方案，微流控技术结合了这些繁琐的预处理步骤，使其可用于EV-miRNA检测。因此，本章分为三个核心部分：（1）EV

展望与未来方向

凭借无创液体活检和快速诊断的能力，EV-miRNAs已成为精准医学研究中的关键生物标志物，在疾病预防、筛查、诊断、治疗监测和预后评估等多个临床场景中显示出巨大的应用潜力。迄今为止，已经开发了多种先进的EV-miRNA检测技术。值得注意的是，集成微流控设备的概念

CRediT作者贡献声明

王梦曦：撰写——原始草稿、可视化、实验设计、数据管理。胡琴琴：撰写——审稿与编辑、监督、实验设计、资金获取、概念构思。修乐山：实验研究。尹坤：监督、资金获取、概念构思

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

本文描述的研究未使用任何数据。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（22474076）、上海市卫生健康委员会项目（202340069）和上海东方人才计划（青年项目）（编号NA）的支持。