《Ultrasonics》：Evaluation of the location and probability of acoustic cavitation in healthy and cancerous 3D cell cultures
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本研究聚焦生物组织微环境中气泡核的分布，通过聚焦超声诱导声空化，对比了四种大鼠来源的健康与癌细胞系（骨骼肌细胞L-6、L-8；肝细胞BRL-3A、McA-RH7777）在两种商用三维支架中的空化行为。研究发现空化仅发生在细胞外基质，健康骨骼肌细胞的空化阈值显著低于其癌变对应细胞，脉冲长度增加可降低空化阈值。研究结果为理解临床治疗超声应用中空化的位置和调控机制提供了新见解。
在医学影像的世界里，超声波因其安全、无创、实时等优点，已成为临床检查的“常规武器”。然而，当超声波的能量足够强时，会在液体或组织中引发一种奇特的物理现象——声空化，即预先存在的气泡核在交变声压作用下剧烈膨胀与坍塌。这一过程在对比增强成像或治疗领域被小心地利用，以期实现精准的药物输送或靶向组织消融等“定点爆破”效果。但问题也随之而来：人体组织并非均匀的“一潭死水”，而是由细胞、细胞外基质等构成的复杂、异质性极高的“微环境”。那么，在这种复杂的“微环境”中，作为声空化“种子”的气泡核究竟藏身何处？是潜伏在细胞内部，还是散落在细胞外基质？在不同状态（如健康或癌变）的细胞周围，引爆这些“种子”所需的“能量”（即空化阈值）又有何不同？这些“黑匣子”般的知识，正制约着我们对治疗超声作用机制的深入理解。
为了解开这些谜团，研究人员在《Ultrasonics》期刊上发表了一项研究。他们选择了一个折中且可控的平台——三维细胞培养系统，将四种大鼠来源的健康与癌细胞（骨骼肌细胞L-6与L-8；肝细胞BRL-3A与McA-RH7777）分别植入两种商用水凝胶支架中，构建了体外三维组织模型。然后，他们使用一台3.68 MHz的聚焦超声换能器，像狙击手一样将超声波精准聚焦于这些三维细胞团块，并用高速相机和倒置显微镜实时捕捉声波焦点处气泡的“诞生”与“消亡”。这项研究旨在回答两个核心问题：声空化在细胞层面究竟发生在哪里？健康与癌变状态是否会影响气泡“种子”的引爆难度？
研究者运用了多个关键技术方法来回答上述问题。聚焦超声（FUS）诱导空化：使用单阵元聚焦超声换能器（频率3.68 MHz）产生微秒级脉冲，在三维细胞样品中诱发低密度空化，并通过原位测量校准峰值负压（p-）。高速光学成像与显微镜技术：结合倒置显微镜和高速摄影系统（20,000帧每秒），对超声暴露期间的细胞及其周围环境进行实时显微观察，用于定位空化事件和记录气泡动力学。三维细胞培养：使用PureCol? EZ-Gel（胶原I水凝胶）和Cultrex? Ultimatrix（基底膜提取物）两种商用水凝胶支架，将四种大鼠来源的健康与癌细胞系（样本总数40个）分别进行三维培养，模拟组织微环境。原子力显微镜（AFM）：利用原子力显微镜的定量纳米力学映射（峰值力轻敲）模式，在磷酸盐缓冲液中测量四种细胞类型的杨氏模量（细胞硬度），以分析其机械特性与空化行为的关系。图像分析与统计建模：利用ImageJ和MATLAB软件对高倍图像进行处理，量化细胞面积覆盖率、细胞/气泡尺寸；并采用逻辑函数拟合和广义线性模型（GLM）等统计方法分析空化概率曲线和阈值差异。
研究结果部分揭示了多个有趣的发现。
3.1 三维细胞环境中的空化活动
空化活动被定义为超声暴露期间声学焦点内出现的瞬态深色圆形区域。在全部40个样本的所有测试细胞类型和支架条件下，均未在细胞内观察到任何空化活动。所有气泡的形成均被证实仅发生于细胞外支架内，且位置随机。
3.2 疾病状态和脉冲长度对声空化阈值的影响
研究发现，健康骨骼肌细胞（L-6）的空化阈值显著低于其癌变对应细胞（L-8）。例如，在200 μs脉冲下，PureCol支架中健康细胞的阈值约4.1 MPa，而癌细胞为4.9 MPa。
然而，这一趋势在肝细胞中并不明显，健康（BRL-3A）与癌变（McA-RH7777）肝细胞的阈值相似。
此外，一个普遍规律是：增加脉冲长度（从200 μs增至300 μs）在所有细胞-支架组合中一致性地降低了空化阈值。
3.3 细胞接种与无细胞支架的空化阈值比较
将细胞接种的支架与不含细胞的“空”支架进行对比发现，细胞的存在通常降低了空化阈值，即细胞使得支架更容易发生空化。
3.4 原子力显微镜的细胞硬度测量
通过原子力显微镜（AFM）测量发现，两种组织来源的癌细胞（L-8和McA-RH7777）的硬度均显著高于其对应的健康细胞（L-6和BRL-3A）。
值得注意的是，所有细胞的硬度（约3-46 kPa）都远高于其所在的支架硬度（约150-900 Pa）。
3.5 三维培养中的细胞面积覆盖率
细胞在三维支架中的覆盖行为因类型而异。骨骼肌细胞呈分支状延展，覆盖面积较大；而肝细胞则倾向于形成致密的球体，覆盖面积相对较小。癌细胞McA-RH7777在Cultrex支架中的覆盖率显著低于PureCol支架。
3.6 细胞与气泡尺寸分析
分析表明，在两种支架中，健康细胞的最大宽度普遍大于其癌变对应细胞，但差异未达统计显著水平。所有细胞类型的尺寸均显著大于实验中所测气泡的最大直径（约10-11 μm），表明气泡在物理尺寸上完全可能被容纳在细胞之间。
3.7 空化事件的统计分析
基于40个样本中均未观察到细胞内空化的结果，进行了严格的统计检验。在假定细胞内空化发生概率为10%的原假设下，得到40次试验均未发生的概率小于0.05。这提供了统计学上的显著证据，表明在当前实验条件下，细胞内空化的发生概率很可能低于10%。
研究结论与讨论部分对上述发现进行了深入剖析与总结。本研究的主要结论清晰而有力：在三维细胞培养环境中，聚焦超声诱导的声空化事件几乎完全局限在细胞外基质（ECM）中，细胞内空化则未在实验中被观测到。这一观察结果得到了统计学分析的支持，并与细胞与其周围支架间的力学特性差异高度吻合。研究人员利用原子力显微镜（AFM）测得细胞的杨氏模量（约3-46 kPa）远高于支架的弹性模量（约150-900 Pa）。这意味着支架作为一种柔软得多、阻力更小的介质，为气泡核的膨胀和坍塌提供了远比刚性细胞内部更有利的“温床”。这一发现强调了细胞-ECM相对刚度在决定空化位点中的关键作用，并为理解体内空化机制提供了重要的实验依据。
进一步，研究揭示了空化阈值受多种因素调控的复杂性。首先，疾病状态（健康 vs. 癌变）的影响具有组织特异性。在骨骼肌细胞中，健康细胞的空化阈值显著低于癌细胞，这可能与健康骨骼肌细胞（L-6）能分泌并修饰细胞外基质（ECM）的特性有关，从而改变了局部的力学或化学环境，更易诱发空化。而在肝细胞中，这种差异并不显著，暗示了不同组织来源的细胞其空化行为可能受不同的微环境因子主导。其次，一个普遍适用的规律是：增加超声脉冲长度会系统地降低空化阈值，这为优化超声治疗参数提供了直接参考。最后，将细胞接种的支架与无细胞支架对比发现，细胞的存在总体上降低了支架的空化阈值，凸显了生物成分对材料空化行为的“调制”效应。
本研究的发现对于新兴的超声治疗应用，如组织消融术（Histotripsy）和药物输送，具有重要的启示意义。它提示我们，在设计此类疗法时，需要充分考虑目标组织的微观结构和机械异质性。例如，当针对肿瘤进行治疗时，可能需要根据肿瘤与其周围正常组织在细胞硬度、细胞外基质组成等方面的差异，来预测和调控空化发生的位置与强度，以期实现更精准、更安全的治疗效果。当然，研究也存在局限，例如成像系统的时间和空间分辨率未能捕捉到纳米级的早期事件或膜附近微小变化，且仅使用了一个单一的频率。未来的研究可以通过采用超高帧频成像、多频率超声以及弹性模量可调的支架，来进一步深化对细胞内与细胞外空化动力学差异的理解。
总之，这项研究通过对三维细胞培养模型中声空化行为的精细成像和定量分析，不仅证实了空化主要发生在细胞外，还系统揭示了细胞状态、脉冲参数和支架环境如何共同影响这一物理过程的启动门槛。它为从微观层面理解治疗超声的生物物理机制迈出了坚实的一步，为未来开发更智能、更精准的超声治疗策略奠定了理论基础。
