文昌猪是中国热带省份海南省特有的极度濒危本土猪品种，由于其历史上的种群数量下降和遗传多样性有限，亟需进行保护（Zhong et al., 2023）。根据最新的官方普查数据（文昌市政府，2024年），截至2024年11月25日，其核心繁殖种群数量已增加到约300头，表明其濒危状况有所缓解。尽管取得了这一进展，但人工授精作为遗传保护的基本策略，在低温精液保存（例如4℃）方面仍存在技术瓶颈，优化冷储存过程中的代谢抑制与结构完整性之间的平衡仍然是一个重大挑战。在4℃下，精子面临双重挑战：（1）氧化应激引起的损伤，这是由于胆固醇/磷脂比例低导致精子膜不稳定，从而容易积累过多的活性氧（ROS），引发脂质过氧化、DNA片段化和线粒体功能障碍，最终导致细胞凋亡并加速质量恶化；（2）能量代谢受损，表现为线粒体膜电位（ΔΨm）下降和ATP耗竭，这与AMPK信号通路的失活以及其他因素（如膜流动性紊乱和Ca2?失衡）有关（Hai et al., 2025, Jing et al., 2023）。这些未解决的挑战凸显了迫切需要先进的保存添加剂，以同时减轻氧化损伤并重新激活能量代谢途径，从而在长时间低温储存期间维持精子功能。
Pinobanksin（PB）是一种主要从蜂胶中提取的二氢黄酮醇，蜂胶是由蜜蜂产生的天然树脂物质（Dos Santos et al., 2024）。其化学结构包含一个2-phenylchroman-3-one骨架，在5、7和4'位置有三个羟基，这些羟基通过直接清除ROS和螯合Fe2?等过渡金属共同赋予其强大的抗氧化活性（Elangovan, 2024, Okińczyc et al., 2021）。最新研究还发现，PB可以激活Nrf2信号通路，在氧化应激模型中通过上调谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平来增强内源性抗氧化防御（Xu et al., 2022）。除了抗氧化特性外，越来越多的证据表明PB具有抗炎作用，特别是通过调节NF-κB信号通路及其下游靶点来抑制促炎介质（如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）（Bi et al., 2024, Xu et al., 2022）。Pinobanksin独特地调节氧化还原平衡和能量代谢，使其特别适合应对低温精液保存中的多因素压力（Zheng et al., 2018）。
精子的运动能力和顶体反应高度依赖于能量平衡，AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）是这一过程的核心调节因子。研究表明，细胞外Ca2?的流入会激活钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶激酶（CaMKKβ），从而诱导AMPK Thr172位点的磷酸化，维持线粒体能量代谢和精子活力（Kong et al., 2024, McAloon et al., 2024, Petsouki et al., 2022）。抑制CaMKK（例如使用STO-609处理）会显著降低AMPK活性，导致ATP耗竭和顶体反应受损，从而证实了这一信号通路对精子正常功能的必要性（Nguyen et al., 2016）。然而，低温保存引起的Ca2?平衡失调可能会破坏CaMKK/AMPK信号通路，加剧能量代谢危机（Nakamura et al., 2021）。有趣的是，像槲皮素和染料木素这样的黄酮类化合物已经因其抗氧化特性而被用于精液稀释剂中，在非配子细胞模型中显示出依赖于CaMKKβ的AMPK激活作用，有效恢复了代谢应激下的能量平衡（Dhanya et al., 2017, Ferramosca et al., 2021, Hsu et al., 2011）。这种跨细胞类型的保守调节机制表明，包括pinobanksin在内的蜂胶来源黄酮类化合物可能具有激活精子中CaMKK/AMPK信号通路的潜力，从而补充其已知的抗氧化功能。
本研究探讨了pinobanksin在4℃下保存文昌猪精液时的细胞保护作用。通过整合氧化应激调节（Nrf2通路）的机制见解，并探索其与AMPK信号通路在能量代谢中的相互作用，我们旨在建立一种新的策略，以提高精液质量并延长这一濒危品种的繁殖利用价值。我们的发现不仅有助于推进用于遗传保护的人工授精技术，也有助于解决猪精液保存中的更广泛问题。
