《Virology》：An Adenovirus-Vectored Strategy Expressing IFN-λ3 and IL-22 Protects Neonatal Piglets from Porcine Epidemic Diarrhea Virus
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基于腺病毒载体共表达干扰素λ3和白细胞介素22的新型抗PEDV策略在体外和体内实验中均表现出显著抗病毒活性及黏膜保护效果，可有效降低新生猪腹泻发生率并改善存活率，为应对PEDV变异提供新思路。
罗毅|冯云朵|丁世豪|刘翔|马彦龙|史彦莉|刘平光
中国农业大学兽医学院兽医公共卫生与安全国家重点实验室，北京100193
摘要
猪流行性腹泻病毒（PEDV）在新生仔猪中引起严重的肠道疾病，通常导致接近100%的死亡率。频繁的基因变异进一步削弱了现有疫苗和控制策略的有效性，凸显了开发新型抗病毒干预措施的迫切需求。在这项研究中，我们开发了一种重组腺病毒载体策略（rAd5-IFNλ3-IL22），该策略同时表达干扰素λ3（IFN-λ3）和白细胞介素-22（IL-22），以同时针对病毒复制并减轻上皮损伤。体外实验表明，rAd5-IFNλ3-IL22在293A细胞中表达并分泌IFN-λ3和IL-22，且培养上清液显著上调了IPEC-J2细胞中抗病毒基因（OASL）和黏膜保护基因（Muc1）的转录。进一步的研究发现，用相同的上清液预处理猪空肠肠上皮细胞可显著抑制PEDV株（G2b和G2c）和传染性胃肠炎病毒（TGEV）的复制，显示出对遗传上不同的PEDV株和TGEV的抗病毒效果。体内实验中，给新生仔猪口服rAd5-IFNλ3-IL22可延缓腹泻发作，减轻绒毛萎缩，并减少病毒复制和排毒，从而显著提高存活率。关键的是，在与生产环境极为相似的母猪饲养条件下，处理过的仔猪表现出疾病进展延迟、病毒排毒量显著减少以及体重增加。这些结果表明，rAd5-IFNλ3-IL22能有效预防PEDV并减轻新生仔猪的病毒负担，显示出其作为控制猪PEDV的潜在抗病毒干预措施的可行性。需要注意的是，由于缺乏体内空载体对照组，观察到的保护效果可能是IFN-λ3/IL-22表达和Ad5载体介导的先天免疫激活的共同作用结果。
引言
猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种属于Alphacoronavirus属的包膜正链RNA病毒，仍然是养猪业中最具破坏性的病原体之一（Li等人，2023年）。新生仔猪感染后常因严重的肠道疾病而几乎100%死亡，导致全球范围内的重大经济损失（Yang等人，2023年）。尽管已经开发了几种商业疫苗，但由于PEDV的高基因变异性，其保护效果并不一致（Li等人，2025年；Su等人，2024年）。重要的是，目前尚无特定的治疗药物，PEDV仍在广泛传播（He等人，2022年），这凸显了开发能够提供广泛有效保护的新型策略的迫切需求。
PEDV主要攻击小肠上皮细胞（Zhou等人，2021年），导致绒毛萎缩和上皮脱落，进而引发吸收不良和严重腹泻。由于新生仔猪的肠道上皮细胞更新速度相对较慢（大约7天），感染往往会导致持续性腹泻和致命性脱水（Moon等人，1973年）。因此，有效的PEDV干预措施不仅应抑制病毒复制，还应减轻黏膜损伤并维持肠道功能（Jung等人，2015年）。干扰素λ（IFN-λ）主要作用于黏膜上皮细胞，并对多种肠道冠状病毒（包括PEDV）表现出广谱抗病毒活性，使其成为控制PEDV的有希望的候选药物（Yin等人，2021年）。在这一家族中，IFN-λ3对PEDV的抑制作用比IFN-λ1更强（Dellgren等人，2009年；Li等人，2019b年；Shin等人，2022年）。同时，白细胞介素-22（IL-22）在上皮再生和修复中起关键作用，还能增强抗菌肽的分泌和黏液屏障功能（Li等人，2019c年；Peng等人，2022年；Sonnenberg等人，2011年）。因此，结合使用IFN-λ3和IL-22可能通过抑制病毒复制和加速肠道恢复来提供双重益处。
有效的体内递送还依赖于合适的载体。据报道，腺病毒5型（Ad5）能高效转导猪肠道组织，转基因表达在感染后24-48小时达到峰值（Torres等人，1996年）。利用这一特性，基于Ad5的载体可以快速局部表达IFN-λ3和IL-22，从而提供早期抗病毒作用，同时减轻肠道损伤。
基于这一原理，我们构建了一种重组腺病毒rAd5-IFNλ3-IL22，旨在同时表达干扰素λ3（IFN-λ3）和白细胞介素-22（IL-22）。这种双细胞因子方法旨在结合抗病毒作用和黏膜保护，从而提供一种潜在的PEDV干预策略。在本研究中，我们评估了rAd5-IFNλ3-IL22的体外生物活性，并评估了其在新生仔猪中的保护效果。
病毒和细胞
PEDV-JMS株（基因型G2b，GenBank登录号PP461398）、PEDV-JX株（基因型G2c，GenBank登录号PV902815）和TGEV株（GenBank登录号EU074218）保存在我们的实验室中。HEK293细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，产品编号10091148）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。猪肠道上皮细胞（IPEC-J2）在含有10% FBS的DMEM/F12培养基中培养。
重组腺病毒rAd5-IFNλ3-IL22的构建
鉴于有效的PEDV干预措施必须同时提供抗病毒保护、减轻肠道损伤并实现向肠道上皮的有效递送，我们设计了一种同时表达IFN-λ3和IL-22的重组腺病毒。这两种细胞因子通过P2A自切割肽连接，并插入Ad5穿梭质粒骨架中（图1A）。经过PacI消化后，琼脂糖凝胶电泳得到两个片段，其中一个片段大于15 kb。
讨论
猪流行性腹泻病毒（PEDV）在新生仔猪中导致极高的死亡率，仍然是养猪业面临的主要挑战。流行病学调查显示，G2基因型菌株占主导地位（Zhang等人，2023年），其中G2c是最主要的亚型（Li等人，2022年；Xie等人，2025年），而G2a和G2b也对病毒传播有显著贡献（Shi等人，2024年；Xu等人，2024年；Yu等人，2023年）。
伦理批准和参与同意
所有动物实验均遵循动物研究伦理使用指南进行。研究方案已由Zhao Fenghua生物技术公司的动物伦理委员会审查并批准（批准编号202307，批准日期2023年3月15日）。在参与实验前，已从仔猪所有者处获得书面知情同意。我们尽一切努力减少动物的痛苦并减少实验中使用的动物数量。
CRediT作者贡献声明
罗毅：撰写——原始草案、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。丁世豪：方法学、研究。冯云朵：方法学、研究、数据管理。马彦龙：方法学、研究。刘翔：方法学、研究。刘平光：撰写——原始草案、监督、资源协调、项目管理、研究、资金筹集、数据管理、概念构思。史彦莉：方法学、研究
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。所有作者均审阅、修订并批准了手稿。
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在本文及其补充信息文件中。
资金支持
本项工作的支持来自国家重点研发计划（2025YFD1800902）和中国自然科学基金（32573374）。资助方未参与研究设计、数据收集与分析、发表决定或手稿准备。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。
