《Water Research》：Unveiling the adaptive evolution of halotolerant aceticlastic methanogenesis: Multi-scale responses and energy partition
编辑推荐：
产乙酸型甲烷古菌在长期实验室进化中通过基因水平转移和代谢重编程实现高盐耐受，其代谢网络调整优化能量分配，在5% NaCl下达到82.25%的乙酸理论转化率，为高盐废水生物处理提供新策略。
郭慧媛|刘青|韩 Hexing|徐伟超|史万胜|赵明星|肖欣|刘建伟|李廷刚
中国科学院过程工程研究所绿色制造创新研究院，绿色回收战略金属资源国家工程研究中心，绿色工艺与工程重点实验室，北京，100190，中国
摘要
含盐有机废水中的高浓度盐离子对废水处理技术构成了重大挑战，尤其是对厌氧消化器的稳定性产生了影响。乙酸裂解甲烷生成是通过甲烷古菌将乙酸盐转化为甲烷的关键途径，但其代谢过程受到盐胁迫的负面影响。为了解决这一问题，我们进行了长期适应性实验室进化（ALE）实验，以培养耐盐的乙酸裂解甲烷古菌。实验结合了宏基因组学、宏转录组测序、代谢组学和代谢建模技术，以揭示遗传和代谢响应。进化后的微生物组在5%氯化钠浓度下甲烷生成活性显著提高，达到了82.25%的乙酸盐理论转化率，远超原始微生物组的表现。该ALE过程克服了高盐环境中乙酸裂解甲烷古菌的自然稀缺性。关键的适应机制主要体现在转录水平上，涉及无机离子转运、兼容溶质吸收和从头生物合成的基因上调。水平基因转移也发挥了重要作用，特别是那些与兼容溶质转运相关的基因，表明了一种能量效率更高的适应策略，即积累溶质而非合成溶质。代谢通量分析表明，盐胁迫下的能量分配调整是由合成兼容溶质的能量成本驱动的，这突显了溶质转运蛋白在能量保存中的重要性。本研究阐明了代谢重编程与基因转移在增强微生物盐胁迫适应性方面的复杂相互作用，从而加深了我们对极端环境中微生物适应性的理解，并推动了含盐废水处理的生物技术方法的发展。
引言
含盐有机废水的处理是一个全球性的环境挑战，这类废水占全球制药、皮革和石化制造工业废水的5%以上（Hoang Nhat Phong等人，2020年；Yang等人，2013年）。传统的处理方法，包括机械蒸汽压缩、生物电化学系统和正向渗透，由于成本高昂和能耗大而常常不切实际（Liu等人，2024年；Yan等人，2024年；Yang等人，2016年）。生物方法，特别是厌氧处理技术，提供了一个有前景的替代方案（Elahinik等人，2024年；Han等人，2023年）。这些过程不仅能有效处理废水，还能产生甲烷作为可持续生物燃料。在厌氧消化系统中，甲烷生成古菌起着关键作用，它们从氢气、乙酸盐和甲基化化合物等发酵产物中生成甲烷。根据底物利用方式，甲烷生成古菌可分为四类：氢营养型、乙酸裂解型、甲基营养型和依赖H?的甲基营养型（Evans等人，2019年）。其中，乙酸裂解型甲烷古菌尤为重要，因为它们可以防止乙酸盐积累并确保复杂有机物的有效分解（McKay等人，2022年；Song等人，2024年）。它们对乙酸盐的代谢维持了热力学上有利的梯度，推动了碳和电子的流动，使其成为这些系统中的关键中间体（Guo等人，2023年）。然而，含盐废水中的高盐度从根本上削弱了它们的代谢效率（Song等人，2023年）。
甲烷生成古菌在高盐环境中面临重大挑战（通常定义为盐度>3.5%），尤其是有毒钠离子的侵入和需要能量密集型渗透调节的渗透胁迫（Guo等人，2023年；Song等人，2023年）。为了缓解这些压力，甲烷生成古菌采用了离子转运和兼容溶质积累等策略（Sorokin等人，2017年）。这些适应过程需要广泛的生理调整（Vyrides和Stuckey，2017年），并且对能量预算本来就较低的甲烷生成古菌来说，会带来巨大的ATP消耗（Evans等人，2019年；Valentine，2007年）。通过不同甲烷生成途径获得的能量收益排序如下：甲基营养型甲烷生成（ΔG?' = ?49至?113 kJ/mol CH?）> 氢营养型甲烷生成（ΔG?' = ?131 kJ/mol CH?，但通常为?37至?130 kJ/mol CH?）> 乙酸裂解型甲烷生成（ΔG?' = ?33 kJ/mol CH?）（Thauer等人，2008年；Lyu等人，2018年；McGenity和Sorokin，2018年）。在自然高盐环境中，这种较低的标准能量收益使得乙酸裂解型甲烷古菌在热力学上处于劣势，相对于甲基营养型和氢营养型甲烷生成古菌（Thauer等人，2008年；Lyu等人，2018年；McGenity和Sorokin，2018年）。这种热力学限制与生态观察结果一致，即纯甲烷生成菌株生长的最大盐度阈值对于乙酸盐（4% w/v NaCl）明显低于甲基胺（27% w/v NaCl）或H?/CO?（12% w/v NaCl）（McGenity和Sorokin，2018年）。此外，在富含硫酸盐的含盐环境中，甲烷生成古菌还面临来自硫酸盐还原菌（SRB）的显著底物竞争，由于后者具有更有利的热力学优势（Oren，2011年；Zhou等人，2011年）。在高盐条件下，这种能量优势更加明显，因为更高的能量收益使SRB能够更好地承担渗透调节的成本，进一步排挤了接近其热力学极限运行的甲烷生成古菌（Oren，2011年；Zhou等人，2011年）。综上所述，这些热力学和竞争因素解释了乙酸裂解型甲烷古菌在自然高盐环境中罕见的原因。
鉴于乙酸裂解型甲烷古菌对盐胁迫的敏感性及其在厌氧消化系统中的关键作用，培养耐盐的乙酸裂解型甲烷古菌对于维持含盐有机废水处理的厌氧系统的可持续运行至关重要。长期适应性实验室进化（ALE）是一种有前景的策略。近年来，结合多组学的ALE已被证明是揭示复杂且往往非直观的适应机制的强大工具（Fait等人，2022年；Espinosa等人，2020年）。里程碑式的研究利用这种方法揭示了特定点突变如何赋予新的特性（如耐热性（Caspeta等人，2014年），以及微生物如何通过重组整个代谢网络和重新分配蛋白质资源来优化生物能量（Anand等人，2022年）。对于微生物群落而言，ALE表明水平基因转移（HGT）可以是进化的主导和快速驱动力，使它们能够从群体基因库中快速获得复杂特性（Power等人，2021年）。这些原则在厌氧系统中尤为重要，因为那里的能量限制和种间依赖性使得这种适应策略对于生存和功能至关重要。
因此，我们采用了微生物组水平的ALE策略来研究微生物对高盐度的全面适应。通过整合宏基因组学和宏转录组测序、非靶向代谢组学以及代谢模型的综合多组学方法，阐明了耐盐机制和种间水平基因转移的机制。本研究提供了关于高盐胁迫下甲烷生成古菌代谢通量分布和能量调节的微生物组水平见解，并展示了适应性进化的微生物在可持续含盐废水处理中的潜力。
厌氧富集和适应性实验室进化的批次微宇宙
ALE实验使用120毫升的厌氧血清瓶进行，每个瓶子有三个独立重复样本，接种了原始的厌氧颗粒污泥（详细信息见补充材料和方法S1和S2）。培养物在37°C下以200 rpm的速度振荡培养，并在含有100 mM乙酸盐作为唯一碳源的培养基中连续传代（培养基组成见补充材料和方法S3）。每个批次周期（通常为12-16天）持续进行，直到...
盐胁迫下甲烷古菌群落的连续适应性实验室进化
为了使甲烷生成菌群落能够克服盐胁迫引起的生长障碍，我们在300天的时间内进行了适应性实验室进化（ALE）实验，使用了三个独立重复样本。起始接种物是含有丰富乙酸裂解甲烷古菌和复杂微生物组成的原始厌氧颗粒污泥。通过逐步增加盐度从1%到5% NaCl，然后在5% NaCl下稳定...
结论
本研究揭示了耐盐乙酸裂解型甲烷古菌在盐胁迫下的多层次适应性和生态动态。通过ALE，我们成功地将盐敏感的乙酸裂解型甲烷古菌适应到了高盐度条件，鉴于它们在厌氧消化中的核心作用，这是一个重要的成就。全面的多组学分析揭示了它们在盐胁迫下生存和繁衍的复杂适应机制，我们的结果强调了HGT的关键作用。
数据可用性
所有原始宏基因组数据均可在NCBI的Bioproject Accession PRJNA1227991上获取。
手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明
在准备这项工作时，作者使用了Gemini工具来改进语言表达。使用该工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。
CRediT作者贡献声明
郭慧媛：写作——审阅与编辑、初稿撰写、可视化、验证、软件应用、方法学设计、实验设计、数据分析、概念化。刘青：初稿撰写、软件应用、方法学设计。韩Hexing：可视化、验证、实验设计。徐伟超：初稿撰写、可视化、软件应用、数据分析、概念化。史万胜：可视化、资源管理、项目协调。赵明星：
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2021YFC2102203）、国家自然科学基金（编号52470166）和江西省****（JXSQ2023201003）的支持。
