一种基于AuPt-石墨烯薄膜的柔性天线免疫传感器，用于无线检测破伤风毒素

《Analytica Chimica Acta》：A flexible antenna immunosensor with AuPt-graphene film for wireless detection of tetanus toxin

检测破伤风毒素的高灵敏度无线免疫传感器设计

　　

田梦雅|宣秀伟|刘成|李宏基|李明基

天津工业大学集成电路科学与工程学院薄膜电子与通信器件国家重点实验室，中国天津市300384

摘要

背景

破伤风的危险源于由破伤风梭菌产生的破伤风毒素（TT）。这种毒素主要攻击中枢神经系统，导致严重的多系统损伤，甚至威胁生命。它的毒性极强，人体致死剂量仅为2.5 ng/kg。然而，传统的诊断方法依赖于临床表现，缺乏定量指标，因此难以进行快速和现场的诊断。因此，有必要研究无标记、实时和无线的检测方式。

结果

本文介绍了一种基于紧凑型柔性天线的免疫传感器，用于检测TT，旨在克服上述技术挑战。该传感器工作在工业科学医疗（ISM）频段的2.45 GHz，具有独特的结构，尺寸仅为14×14×3 mm3，并可实现最远15米的无线感应范围。在辐射贴片上沉积了经过AuPt纳米粒子改性的石墨烯薄膜作为敏感层。TT浓度的变化会导致天线免疫传感器的共振频率发生变化，这是由于特定的抗体-抗原结合作用，从而实现TT的定量检测。该免疫传感器的灵敏度为2.755 MHz/lg(fg/mL)，抗原浓度范围为10?1至10? fg/mL。对免疫传感器的全面性能分析表明，它具有显著的再生能力、重复性、长期稳定性和特异性。在实际应用中，从离心血液样本中准确检测到了相应的TT浓度，结果被验证为可靠。这表明使用灭活的破伤风类毒素作为天然毒素的替代品可以获得有效且令人信服的检测结果。

意义

本研究将微波传感技术与高度特异性的生物识别抗体结合，创造出一种新的破伤风毒素检测方法。天线免疫传感器利用毒素结合前后的共振频率变化实现无标记、实时和无线检测。此外，这项研究为高度集成、微型化的传感平台提供了一种有前景的替代方案，能够进行连续监测。

引言

破伤风毒素（TT）是由破伤风梭菌在厌氧条件下产生的一种外毒素，被认为是目前已知的最强效的生物毒素之一[1]。通过伤口进入人体后，破伤风毒素迅速与中枢神经系统运动神经元表面的神经节苷脂受体结合[2]。随后通过轴突逆向运输到脊髓和脑干，在那里抑制抑制性神经递质的释放[3]。这种破坏会导致骨骼肌的广泛性强直性痉挛，临床表现为牙关紧闭（trismus）、角弓反张（opisthotonus）和呼吸肌麻痹。该疾病的死亡率可达到10%～40%，尤其是在未完成标准疫苗接种方案的人群中尤为严重[4]。

虽然可以通过清创、破伤风疫苗接种和抗毒素注射来预防破伤风[5]，但快速准确的毒素检测仍然是指导临床管理和降低疑似病例死亡率的关键步骤——尤其是在出现早期症状或伤口严重污染的情况下[6]。然而，破伤风毒素的检测长期以来一直受到多种技术挑战的困扰[7]。首先，毒素在人体内的分布具有高度选择性[8]，血液或体液中的游离毒素浓度极低——这使得传统检测方法无法有效捕获它。其次，毒素具有复杂的结构，由重链和轻链通过二硫键连接；传统的免疫测定方法容易受到样品基质的干扰[9]，难以平衡测定的特异性和灵敏度。虽然金标准的小鼠生物测定法具有高灵敏度[10]，但它存在耗时、成本高以及依赖动物伦理合规性的缺点[11]。相比之下，质谱法具有很强的特异性和准确的定量能力[12]；然而，其广泛应用受到昂贵设备和高技术门槛的阻碍[13]。鉴于这些挑战，开发简单、经济高效且高灵敏度的新型诊断方法至关重要[14]。

柔性天线传感器能够长期动态监测人体生理信号，从而为慢性疾病的管理和重症监护提供准确的数据支持[15]、[16]、[17]。在心血管健康监测中，可以将柔性天线与压力感应单元集成到胸部或手腕上，实时采集心电图（ECG）和动脉脉波等信号[18]。这些信号通过无线模块传输到终端设备，能够早期预警心律失常和心肌缺血等异常情况。对于糖尿病患者，柔性天线葡萄糖传感器可以通过皮下组织间液检测血糖浓度[19]。它们的柔性基底具有优异的皮肤粘附性，支持7～14天的连续监测，消除了传统指尖采血带来的疼痛和误差[20]。在呼吸功能监测中，基于聚酰亚胺基底的柔性天线传感器可以集成到口罩或胸贴中；它们通过测量胸壁运动的幅度和频率来监测呼吸状态，适用于慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者的家庭监测。对于神经系统疾病患者，柔性天线传感器可以附着在头皮上收集脑电图（EEG）信号[21]。它们的轻质特性最小化了了对患者日常活动的干扰，有助于分析癫痫发作模式和诊断睡眠障碍。该设计将免疫测定功能整合到了现有的柔性天线传感器性能组合中。2024年，我们提出了一种基于镀金石墨烯薄膜的可植入天线免疫传感器，用于无线检测癌胚抗原（CEA）。由于尺寸仅为5×3×0.127 mm3，天线的峰值增益仅为-18.2 dB[22]。

在本研究中，我们提出了一种新型的柔性天线结构。通过在贴片上沉积经过AuPt纳米粒子改性的石墨烯薄膜，构建了一种用于破伤风毒素监测的柔性天线免疫传感器，如图1所示。辐射贴片采用“2”形弯曲结构，既减少了天线免疫传感器的体积，又在2.45 GHz频率下实现了优异的阻抗匹配。此外，在辐射贴片上还沉积了AuPt纳米粒子：Au纳米粒子主要通过Au-S键、静电吸附或范德华力稳定地定向固定抗体，同时很好地保持了它们的生物活性[23]、[24]。Pt纳米粒子具有优异的电催化活性，能够将微弱的生物识别信号转化为强烈的电信号[25]。单一金属纳米粒子往往无法同时满足生物固定、生物活性保持、电子转移和信号催化的多重要求。通过在辐射贴片上沉积AuPt纳米粒子，这两种效应的协同作用赋予了天线免疫传感器出色的灵敏度特性，测量得到的灵敏度为2.755 MHz/lg(fg/mL)。在辐射贴片上还生长了垂直石墨烯（VG）薄膜。VG薄膜作为三维导电支架，具有高比表面积，有助于高效的电子转移，并为固定AuPt纳米粒子和负载生物分子提供了丰富的位点。为确保实验安全，本研究使用了灭活的破伤风毒素。TT是通过甲醛灭活破伤风毒素得到的产物，其抗原表位与天然毒素完全一致。因此，TT可以特异性地与抗破伤风毒素抗体结合，具有与天然毒素相同的免疫反应性。这一特性使TT成为破伤风疫苗和免疫测定的标准抗原。在破伤风毒素检测研究领域，绝大多数已发表的研究使用灭活的类毒素作为模型抗原[26]、[27]、[28]。当抗破伤风毒素抗体特异性地与石墨烯薄膜表面的抗原结合时，生物分子之间的特异性识别会导致石墨烯薄膜和辐射贴片形成的可变电容发生变化，从而导致天线共振频率的移动。当破伤风毒素抗体（TT-Ab）与石墨烯薄膜上的抗原（Ag）结合时，生物分子之间的特异性识别也会导致共振频率的移动。为了优化免疫传感器的性能，研究了关键参数（包括抗体浓度、抗体孵育时间、抗原孵育时间和抗原溶液pH值）对其性能的影响。随后，根据天线免疫传感器的频率变化评估了其传感性能，并详细描述了无线传感模块。

材料与仪器

由于破伤风毒素的强毒性，实验中使用了灭活的破伤风类毒素而不是破伤风毒素。两者的抗原结构相同，可以触发天线免疫传感器的相同响应。破伤风类毒素来自北京科兴生物技术有限公司。抗TT单克隆抗体购自珠海Trinomab生物制药有限公司。牛血清白蛋白（BSA）：纯度97%，购自上海凌潮生物技术有限公司。

TT免疫传感器的传感原理

在辐射贴片上孵育特定抗体和牛血清白蛋白后，成功组装了TT免疫传感器。TT免疫传感器的传感原理可以根据图1（B）进行解释。随着Ab和BSA在AuPt-VG天线上的组装，改变了局部有效介电常数和电荷分布，从而调节了C₁，共振频率逐渐向低频方向移动。

结论

本研究提出并验证了一种用于检测破伤风毒素的天线免疫传感器。其根本创新在于“天线”和“免疫传感器”的功能集成。通过优化辐射贴片，实现了天线的微型化和高辐射性能。同时，通过使用原位光催化合成的AuPt纳米粒子改性的石墨烯薄膜，实现了传感器的高灵敏度。

CRediT作者贡献声明

田梦雅：研究、数据分析。李明基：撰写——审稿与编辑、方法学、资金获取。李宏基：资源获取、数据分析。刘成：撰写——审稿与编辑、监督、数据分析。宣秀伟：初稿撰写、可视化、方法学、数据分析

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（编号：62271350）和北京大学第一医院国家级高水平医院临床研究资助（青年临床研究项目，编号：2025YC22）的支持。