《Animal Reproduction Science》：Expression，co-localization and interaction analysis of mitochondrial membrane proteins prohibitin and stomatin-like protein 2 during spermatogenesis in
Larimichthys polyactis
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为探究小黄鱼精子发生中PHB和SLP2的功能，分析二者分子特征、表达谱及与线粒体的共定位。结果显示：Lp-PHB含N端疏水区、保守SPFH域和C端螺旋区，Lp-SLP2仅含SPFH域；二者在精子各阶段均与线粒体共定位，且PHB与泛素共定位特征相似，提示二者协同维持线粒体稳态，PHB可能通过介导线粒体泛素化降解异常线粒体，促进精子成熟。
李 Wang|戴文英|刘阳|储世凡|陈银儿|侯聪聪|刘峰|朱俊全|鲍楼
中国浙江省宁波市宁波大学海洋科学学院，教育部应用海洋生物技术重点实验室，邮编315211
摘要
为了研究线粒体膜蛋白prohibitin（PHB）和stomatin样蛋白2（SLP2）在多锯鱼（Larimichthys polyactis）精子发生过程中的潜在功能，我们分析了Lp-PHB和Lp-SLP2的分子特性和表达谱，以及它们在精子发生过程中的共定位情况，还包括Lp-PHB与线粒体的共定位。研究结果表明，Lp-PHB由N端疏水区、保守的SPFH结构域和C端螺旋结构域组成，而Lp-SLP2仅含有保守的SPFH结构域。Lp-PHB和Lp-SLP2基因及其编码蛋白在睾丸中高表达，且这两种蛋白定位于精子发生细胞的线粒体中。在精子发生过程中，Lp-PHB与线粒体、Lp-SLP2与线粒体以及Lp-PHB与泛素之间存在共定位现象：在精原细胞和精母细胞阶段，共定位信号随机分布于核周细胞质中；在精细胞分化为精子阶段，共定位信号逐渐迁移到细胞核的一侧；在成熟精子中，共定位信号聚集在中间段。此外，在整个精子发生过程中，Lp-PHB与泛素以及泛素与线粒体也始终共定位，其共定位特征与Lp-PHB与线粒体的共定位非常相似。这些结果表明，Lp-PHB和Lp-SLP2可能通过相互作用共同维持多锯鱼精子发生过程中的线粒体功能稳态，且Lp-PHB可能通过介导线粒体泛素化参与损伤或多余线粒体的清除，从而促进精子发生的正常进行。
引言
精子发生是一个复杂的过程，精原细胞经历增殖、分化、精母细胞减数分裂以及精细胞成熟，最终形成成熟的精子（Schulz等人，2010；Milani等人，2022）。在此过程中，线粒体在形态、大小、数量和分布方面会发生显著变化。维持线粒体的结构和功能稳态对精子发生的正常进行至关重要（Vertika等人，2020；Wang等人，2003；Peliccione等人，2011；Radaelli等人，2023；Zhao等人，2024）。线粒体结构和功能的稳定性主要依赖于相关蛋白的调控，包括prohibitin（PHB）、stomatin样蛋白2（SLP2）、mitofusin 2和dynamin相关蛋白1（Pfanner等人，2019；Hu等人，2021；Mao等人，2022）。
PHB（PHB1）是一种进化上保守的线粒体内膜蛋白，它与PHB2形成PHB复合物，参与维持线粒体的结构和功能稳定性（Hernando-Rodríguez和Artal-Sanz，2018；Huang等人，2021）。关于PHB在精子发生中的作用已有研究报道，涉及哺乳动物、甲壳类动物和鱼类。在哺乳动物中，PHB的缺乏或表达减少会导致线粒体膜电位降低（MMP）和活性氧（ROS）增加，从而影响精子活力（Wang等人，2012；Chai等人，2017）。在甲壳类动物和鱼类中，PHB在精子发生过程中始终与线粒体信号共定位，表明PHB可能通过影响线粒体功能来调控精子发生（Fang等人，2013；Xu等人，2017；Gao等人，2020；Wang等人，2022；Lin等人，2022）。此外，PHB可作为线粒体泛素化的底物，并参与哺乳动物和甲壳类动物精子发生细胞中受损或多余线粒体的清除（Thompson等人，2003；Fang等人，2013；Dong等人，2015；Xu等人，2017）。然而，PHB是否在鱼类精子发生过程中介导线粒体泛素化尚不清楚。
Stomatin样蛋白2（SLP2）是一种定位于线粒体内膜的蛋白质，在线粒体呼吸链的组装、分裂和融合、生物发生以及钙稳态维持中起重要作用（Da Cruz等人，2010；Christie等人，2011；Hu等人，2021）。其他研究还表明，SLP2可以与PHB相互作用，共同调控线粒体呼吸链的组装、线粒体生物发生以及嵴形态的稳定性，从而维持正常的生理功能（Da Cruz等人，2008；Christie等人，2011；Genin等人，2022）。目前尚无关于SLP2在动物精子发生过程中作用的研究报道。精子发生是一个高度依赖能量的细胞分化过程，需要线粒体的参与。SLP2是否与PHB相互作用共同调控精子发生过程中的线粒体功能仍有待验证。
小黄鲷（Larimichthys polyactis）是中国重要的海洋经济鱼类之一，其人工繁殖和水产养殖已取得成功（Yang等人，2021；Xie等人，2023）。研究多锯鱼的精子发生过程可以为其人工繁殖提供理论依据。Zheng等人（2021）揭示了多锯鱼精子发生过程中线粒体的细胞学特征和动态变化：在精原细胞、精母细胞和早期精细胞阶段，线粒体随机分布于细胞核周围的细胞质中；在中期和晚期精细胞阶段，线粒体聚集在细胞核的一侧；在成熟精子中，线粒体集中在中间段。此前，我们的实验室已对黄鲷（Larimichthys crocea）及其他鱼类物种的精子发生过程中PHB的表达和定位进行了初步研究（Gao等人，2020；Wang等人，2022；Lin等人，2022）。然而，PHB和SLP2是否在鱼类精子发生过程中协同影响线粒体功能尚不清楚。鉴于PHB和SLP2的高度进化保守性，我们推测这两种蛋白质可能调节多锯鱼的线粒体功能，从而影响其精子发生过程。
在本研究中，我们分析了Lp-PHB和Lp-SLP2的分子特性，它们在睾丸不同发育阶段的表达模式，以及Lp-PHB、Lp-SLP2、泛素和线粒体在精子发生过程中的共定位情况。我们的目标是阐明Lp-PHB和Lp-SLP2在多锯鱼精子发生过程中的潜在功能。
实验鱼类和伦理声明
实验用到的L. polyactis鱼来自中国浙江省象山港水产苗业有限公司（2023年12月至2024年12月），每月采集一次样本，每次采集50条鱼（体重15.5–115.6克）。解剖鱼以区分性别，并从雄性个体中采集九种组织（鳃、心脏、肠道、肾脏、大脑、肝脏、睾丸、肌肉和脾脏）。这些组织迅速在液氮中冷冻并储存在-80°C。
多锯鱼（L. polyactis）第二至第五阶段睾丸的组织学特征
组织学观察显示，第二阶段睾丸的生精小叶主要包含精原细胞，这些细胞呈椭圆形或不规则形状，细胞核中有明显的核仁（图1A-B）。第三阶段睾丸的生精小叶腔明显，小叶内主要含有精原细胞和精母细胞。初级精母细胞比精原细胞小得多，细胞核中无明显核仁；次级精母细胞则来源于
多锯鱼（L. polyactis）中PHB和SLP2的结构与表达分析
作为重要的线粒体内膜蛋白，PHB复合物由PHB和PHB2组成，其中PHB是PHB复合物功能执行的关键亚基（Nijtmans等人，2002）。作为SPFH超家族的关键成员，PHB包含N端跨膜结构域SPFH和C端螺旋结构域。SPFH结构域通过与cardiolipin的相互作用维持线粒体的形态和功能稳定性
结论
总结来说，多锯鱼（L. polyactis）精子发生过程中PHB和SLP2的表达模式如图7所示。在多锯鱼的精子发生过程中，发现PHB与SLP2、PHB与线粒体以及SLP2与线粒体之间存在共定位现象。在精原细胞、精母细胞和早期精细胞阶段，共定位信号均匀分布于核周细胞质中；在晚期精细胞阶段，共定位信号逐渐迁移到细胞核的一侧；在成熟精子中，
CRediT作者贡献声明
李 Wang：撰写原始稿件、软件使用、数据分析、概念构建。刘阳：撰写、审稿与编辑。戴文英：撰写原始稿件、方法学设计。陈银儿：数据分析。储世凡：撰写、审稿与编辑。刘峰：撰写、审稿与编辑。侯聪聪：数据分析。鲍楼：撰写、审稿与编辑。朱俊全：撰写、审稿与编辑、资金申请。
致谢
本研究得到了浙江省科技计划项目（项目编号2021C02055、2017C02013）、国家自然科学基金（项目编号31272642）、宁波大学K.C. Wong Magna基金以及浙江海洋高效协同创新中心的支持。
