《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Biological nitrite oxidation in the presence of MnO
2 under anoxic conditions
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针对缺氧环境中亚硝酸盐（NO2–）在锰（Mn）氧化还原循环中的归趋不清问题，研究人员围绕“缺氧条件下生物亚硝酸盐氧化与MnO2还原偶联”这一主题展开研究。结果表明，亚硝酸盐可被生物氧化为硝酸盐（NO3–），同时γ-MnO2被还原；部分还原态Mn物种被再氧化并转化为β-MnO2。该研究证实了亚硝酸盐在Mn生物地球化学循环中的关键中间作用，为理解缺氧氮转化提供了新视角。
在传统认知中，氮的转化往往离不开氧气。污水处理中经典的硝化反应需要氧气将氨氮（NH4+）一步步氧化为亚硝酸盐（NO2–）和硝酸盐（NO3–）。然而，在广袤的湖泊底泥、地下水和一些特殊的水处理环境中，缺氧或无氧条件才是常态。在这些“无氧之地”，氮的去除还能进行吗？大自然给出的答案是肯定的。科学家们发现，一些金属，如铁（Fe）和锰（Mn），可以替代氧气，扮演“电子传递员”的角色，驱动氮的转化。其中，锰因其含量丰富且氧化还原活性高而备受关注。
此前研究已发现两种与锰相关的氮转化过程：锰依赖的厌氧氨氧化（Mnammox，即氨氮氧化偶联Mn(IV)还原）和硝酸盐依赖的锰氧化（NDMO）。然而，作为连接氨氮和硝酸盐的关键中间体——亚硝酸盐，它在锰的氧化还原循环中究竟命运如何？是会被进一步氧化，还是会走向其他归宿？这个环节的缺失，让我们对整个“缺氧锰-氮耦合循环”的拼图始终不完整。为了解答这一谜题，由Yangbo Chen、Hiromi Kambara、Ahmad Shoiful、Shuji Matsushita、Tomonori Kindaichi、Yoshiteru Aoi和Akiyoshi Ohashi组成的研究团队开展了一项深入研究，旨在验证在缺氧条件下，亚硝酸盐能否以MnO2为电子受体，被生物氧化为硝酸盐，并探究其转化路径。这项研究成果已发表在《Biochemical and Biophysical Research Communications》上。
为了探究上述问题，研究人员主要运用了以下几项关键技术方法：首先，他们设计并运行了升流式缺氧生物反应器，以富集目标微生物，并通过控制水力停留时间（HRT）和温度来优化反应条件、评估温度效应。其次，利用X射线衍射（XRD）和X射线光电子能谱（XPS）技术，对反应前后MnO2的晶体结构和锰元素的价态变化进行了表征。再者，通过对反应器内生物膜样本进行16S rRNA基因扩增子测序，分析了微生物群落的组成结构。最后，借助PICRUSt2（系统发育调查）软件工具，基于16S rRNA数据对微生物群落潜在的氮代谢和锰代谢功能基因进行了预测分析。
研究结果
3.1. 反应器性能
3.1.1. Run 1 性能
在Run 1的启动和富集阶段，随着反应器运行，出水中亚硝酸盐和总氮（TN）浓度逐渐下降。虽然未投加有机物，但初期出水中检测到较高的总有机碳（TOC），推测源自接种的稻田土壤。随着运行时间延长，残余有机物被消耗，出水TOC降至约2 mg C L–1，但TN去除率却持续上升。值得注意的是，出水中开始稳定检测到约2 mg N L–1的硝酸盐。通过缩短HRT提高亚硝酸盐负荷后，亚硝酸盐去除率进一步提升，硝酸盐产率也同步增加。运行末期，亚硝酸盐去除率、硝酸盐产率和TN去除率分别达到约118、18和100 mg N L–1d–1。这表明在长期低有机碳背景下，部分亚硝酸盐被氧化为硝酸盐，而其余亚硝酸盐则通过非传统有机质反硝化的其他途径被去除。
3.1.2. 温度对亚硝酸盐去除的影响
研究考察了10 °C至35 °C温度对反应的影响。结果表明，亚硝酸盐去除率和TN去除率随温度降低（20、15、10 °C）而下降，随温度升高（30、35 °C）而恢复。相比之下，硝酸盐产率受温度影响较小，在35 °C时达到最高。这说明与亚硝酸盐还原和氧化相关的微生物活性在低温下较低，在适温下较高。
3.1.3. Run 2 性能
Run 2旨在验证Run 1结果的重复性并探究氮转化路径。使用Run 1富集的生物量接种，在35 °C下运行。结果表明，硝酸盐产率和TN去除成功重现并快速提升。随后，研究人员将进水底物依次更换为硝酸盐、氧化亚氮（N2O）、N2O与亚硝酸盐混合物、以及纯亚硝酸盐。在所有情况下都观察到了TN的去除。当单独供应亚硝酸盐时，进水氮的去除量与氮气（N2）产量基本一致，表明发生了完全反硝化。但当供应N2O时，其消耗量远大于N2产量，意味着大部分N2O未被还原为N2，可能通过其他途径（如吸收、同化）转化。
3.2. 通过XRD和XPS表征MnO2
XRD分析显示，Run 2中原始的γ-MnO2特征峰（如22°处）消失，部分峰向低角度偏移，并出现了β-MnO2的特征衍射峰（28.6°），表明γ-MnO2发生了晶格膨胀和部分相变，生成了热力学更稳定的β-MnO2。
XPS分析进一步证实了锰的还原。Mn 2p3/2谱图分峰显示，经过反应器运行后，Mn(IV)和Mn(III)比例下降，Mn(II)比例上升，尤其是在Run 2中更为明显。通过Mn 3s多重裂分间距计算的平均氧化态（AOS）也从原始γ-MnO2的3.72降至Run 2的3.40。这些结果共同证实了微生物活动导致了MnO2的还原。
3.3. 微生物群落组成
对Run 1和Run 2生物样本的16S rRNA测序分析表明，两个反应器中形成了相似的微生物群落结构。优势门包括Acidobacteriota、Bacteroidota、Chloroflexi和Proteobacteria。在属水平上，两个反应器中 consistently（持续）富集了多个相同的类群，其中两个未分类的类群尤为突出：属于Blastocatellaceae科的OLB17（在Run 2中相对丰度达14.2–14.9%），以及属于Acidithiobacillaceae科的KCM-B-112（在Run 1中为13.3–15.8%）。这种群落结构的相似性与两个反应器中同时发生亚硝酸盐氧化和还原的现象相吻合。
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3.4. 通过PICRUSt2进行功能预测分析
基于PICRUSt2的功能预测显示，微生物群落中含有丰富的氮代谢相关基因。与亚硝酸盐氧化相关的基因（nxrA, nxrB）在Run 2中丰度更高，这与Run 2观察到更高的硝酸盐产率一致。同时，完整的反硝化途径基因（nirK/nirS, norB, nosZ）也被检测到，且丰度可观，这与实验观察到的亚硝酸盐转化为N2的现象相符。此外，同化型和异化型硝酸盐还原基因（如nasA, nirB, nirD）丰度很高，固氮基因（nifH等）也有检出，而氨氧化基因（amoA等）几乎未检出。关于锰代谢，预测到了与锰还原和锰离子转运相关的基因。
研究结论与讨论
本研究提供了确凿证据，表明在缺氧条件下，亚硝酸盐可以在微生物介导下，以MnO2为电子受体，被生物氧化为硝酸盐，同时γ-MnO2被还原为低价态锰物种。更重要的是，研究观察到这些低价态锰物种的一部分被重新氧化，并转化成为一种新的晶体结构——β-MnO2，而非恢复为初始的γ-MnO2。与此同时，一部分亚硝酸盐被还原为氮气。基于两个独立运行的反应器（Run 1和Run 2）所获得的可重复结果，研究人员提出了一个概念模型：在缺氧反应器中，同时发生了锰还原偶联亚硝酸盐氧化，以及低价锰氧化（生成β-MnO2）偶联亚硝酸盐还原的耦合过程。这揭示了亚硝酸盐在生物锰氧化还原循环中扮演着关键中间体的角色。
研究讨论部分深入分析了多个层面。首先，通过对比非生物实验数据和高pH反应条件，排除了非生物氧化主导反应的可能性，强调了微生物过程的关键作用。其次，XRD和XPS结果揭示了MnO2复杂的结构演变，包括晶格膨胀、Mn价态降低以及γ相向β相的转变，这被认为是微生物介导的锰氧化还原循环的物理化学证据。关于氮的归宿，研究证实了亚硝酸盐可经完全反硝化转化为N2，但对于N2O的去除，除了部分还原为N2外，可能还存在其他转化途径（如直接同化），现有功能基因数据尚不能完全解释。此外，也不能排除亚硝酸盐歧化反应或异化型硝酸盐还原为铵（DNRA）等途径存在的可能性，这凸显了锰-氮耦合过程的复杂性。
在微生物机制方面，两个未分类的细菌类群——Blastocatellaceae科的OLB17和Acidithiobacillaceae科的KCM-B-112——在反应器中持续富集。结合已有文献，OLB17可能参与以锰为电子供体的反硝化过程，而KCM-B-112作为化能自养菌，可能参与锰还原偶联亚硝酸盐氧化。然而，仅凭16S rRNA数据无法确定它们的确切功能。未来需要借助宏基因组学、分离培养等手段，来揭示驱动这些耦合反应的具体功能基因和微生物。
综上所述，这项研究不仅首次在实验系统中证实了缺氧条件下生物亚硝酸盐氧化与MnO2还原可以耦合发生，还发现了伴随的锰再氧化与亚硝酸盐还原过程，以及MnO2晶型的转变。这些发现极大地丰富了我们对缺氧环境中金属驱动生物地球化学循环的理解，特别是补齐了“锰-氮耦合循环”中亚硝酸盐转化这一关键环节的认知缺口。研究结果为开发新型低碳氮去除工艺提供了理论依据和潜在的微生物资源，对于应对水体富营养化、优化污水处理技术具有重要的科学意义和应用潜力。
