缺氧响应型紫杉醇前药：连接剂评估与近红外触发自放大光动力-化疗纳米平台

《Biomaterials》：Hypoxia-responsive paclitaxel prodrugs: linker evaluation and NIR-triggered self-amplifying photodynamic-chemotherapy nanoplatform

紫杉醇前药通过设计不同化学键响应缺氧微环境，发现5-硝基呋喃醇修饰型（PTX-NFA）激活效率最高，释放率近99%。构建了PC-Ir@PTX-NFA纳米平台，结合光动力疗法（660nm光照产ROS杀灭癌细胞）和缺氧响应化疗（释放紫杉醇增强疗效），形成自增强治疗循环。系统揭示了前药连接基团的结构-活性关系，为缺氧相关疾病治疗提供新策略。

　　

Furou Lv|Jianxin Rong|Yi Lai|Shutong Lin|Yingjian Cui|Yu Guo|Ruoxue Wang|Jiahui Cong|Haijun Yu|Xiuli Hu

河北工业大学化学工程学院高分子科学与工程学院，天津 300130，中国

摘要

缺氧响应性前药已成为肿瘤选择性治疗的一种有前景的策略，然而，优化响应性连接剂以提高药物释放效率仍然至关重要。在这项工作中，我们系统地设计并成功合成了五种结构不同的缺氧响应性紫杉醇（PTX）前药，确定5-硝基呋喃醇（NFA）修饰的PTX-NFA是最有效的前药，在缺氧条件下几乎完全实现了前药的还原（>99%）和PTX的释放。进一步构建了一种结合光动力疗法和缺氧激活化疗的缺氧响应性纳米治疗平台（PC-Ir@PTX-NFA纳米颗粒）。PC-Ir成分在660纳米光照下产生细胞毒性活性氧，直接杀死肿瘤细胞并加剧缺氧，从而触发PTX的释放，形成一个自我放大的循环。本研究建立了缺氧响应性连接剂的全面结构-活性关系，为未来与缺氧相关疾病的前药开发提供了宝贵的见解。

引言

缺氧是大多数恶性肿瘤的标志性特征，源于癌细胞快速增殖导致的氧气消耗与氧气供应不足之间的不平衡[1]、[2]、[3]。这种缺氧微环境不仅推动了肿瘤的发展，也是多种癌症类型治疗的主要挑战[4]、[5]。在缺氧肿瘤部位发现了多种生理酶（如硝基还原酶和偶氮还原酶）的过表达，并将其视为精确肿瘤治疗的目标[6]、[7]、[8]、[9]。

通过化学修饰，已经广泛探索了多种缺氧激活型前药，这些前药将在肿瘤部位通过缺氧还原转化为强效的毒性物质[10]、[11]、[12]、[13]。几种缺氧激活型前药候选物，包括Tirapazamine（TPZ）、Evofosfamide（TH-302）和AQ4N，已经进入临床试验阶段，证明了缺氧靶向前药激活的概念[14]、[15]、[16]。然而，肿瘤微环境的异质性和肿瘤内缺氧的动态波动导致前药的激活不足[17]、[18]，对其临床应用构成了重大挑战[19]。当前缺氧激活型前药的一个主要限制是它们在中等缺氧区域的细胞毒性不足，这大大降低了它们的治疗潜力[20]。为了解决这些限制，合理设计具有增强激活阈值的新缺氧敏感型前药，或者结合增强缺氧的疗法来放大前药的激活效果，显得特别有前景[21]。开发这种先进的治疗策略是克服当前缺氧靶向癌症治疗障碍的关键方向。

目前的缺氧响应性前药主要使用三类化学连接剂，包括硝基苯衍生物、硝基咪唑和偶氮苯[22]。尽管这些连接剂表现出不同的缺氧敏感性，但对其激活动力学和结构-活性关系的全面比较评估仍然不够充分。这种系统性的评估对于合理优化前药、最大化肿瘤特异性药物释放同时最小化脱靶毒性至关重要。另一方面，单独使用缺氧激活型前药的治疗效果往往有限，这是由于氧气分布不均和激活效率不佳[23]、[24]、[25]、[26]。为了克服这一挑战，同时诱导细胞毒性和放大缺氧的联合疗法已成为一种有前景的解决方案[27]。值得注意的是，光动力疗法（PDT）不仅产生活性氧（ROS）直接杀死癌细胞[5]、[28]，还通过快速消耗氧气加剧缺氧[29]、[30]。这种双重效应形成了一个自我放大的循环：PDT诱导的缺氧增强了前药的激活，而释放的细胞毒性物质则协同增强了PDT介导的肿瘤细胞死亡[31]。

我们之前报道了缺氧激活的偶氮苯连接紫杉醇（PTX）前药[32]。在本研究中，我们通过设计和合成五种新的缺氧激活型PTX前药，扩展了化学范围，包括PTX-NFA、PTX-FNPC、PTX-HMMNI、PTX-NPC和PTX-Azo-PTX，分别使用5-硝基呋喃醇（NFA）、3-氟-4-硝基苯甲醇（FNPC）、1-甲基-5-硝基-2-羟基甲基咪唑（HMMNI）、4-硝基苯甲醇（NPC）和偶氮苯（Azo）作为缺氧敏感连接剂。评估并比较了这五种前药的缺氧响应活性，提供了在不同缺氧敏感连接剂结构下的更全面的结构-活性理解。PTX-NFA被确定为最佳前药，因为它在缺氧条件下具有最高的PTX释放效率。接下来，我们通过将PTX-NFA封装在聚合物光敏剂（PC-Ir）中，构建了一个自我放大的纳米治疗系统（PC-Ir@PTX-NFA纳米颗粒）[33]。该纳米系统具有双重肿瘤靶向能力：（ⅰ）通过静脉给药后的增强渗透性和保留（EPR）效应实现被动积累；（ⅱ）在肿瘤微环境中选择性地激活，同时最小化全身毒性。重要的是，PC-Ir光敏剂具有三个关键功能：（i）作为PTX-NFA递送的纳米载体；（ii）在660纳米光照下生成细胞毒性ROS以诱导肿瘤细胞凋亡；（iii）作为氧气消耗者，通过光动力过程加剧肿瘤缺氧。这形成了一个自我强化的治疗循环：PDT诱导的缺氧增强了PTX-NFA的激活，而释放的细胞毒性物质则协同增强了PDT介导的肿瘤细胞死亡（图1）。

部分摘录

体外药物释放评估

将PTX-NFA溶液（0.4 mg/mL，250 μL）与不同浓度的Na₂S₂O₄（0 mM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM）在脱氧PBS（pH 7.4）中以等体积混合，并在37°C下孵育2小时。孵育后，加入1 mL乙腈以终止反应。最后，通过0.22 μm注射过滤器过滤混合物，并使用高效液相色谱（HPLC）进行测量。测试了PTX-FNPC、PTX-HMMNI、PTX-NPC和PTX-Azo-PTX

缺氧响应性前药的合成与表征

选择了五种硝基芳香族/硝基杂环或偶氮苯化合物（包括NFA、FNPC、HMMNI、NPC和Azo）作为缺氧响应性连接剂，通过定制的合成路线与PTX结合，得到了五种缺氧激活型PTX前药（PTX-NFA、PTX-FNPC、PTX-HMMNI、PTX-NPC、PTX-Azo-PTX），如图1A所示。详细的合成步骤和路线在补充信息（方案S1-S5）中提供。这些前药的化学结构通过质子核磁共振得到了确认

结论

总之，我们系统地设计并评估了五种缺氧响应性PTX前药，包括PTX-NFA、PTX-FNPC、PTX-HMMNI、PTX-NPC和PTX-Azo-PTX，通过结合不同的化学连接剂。全面的比较研究表明，PTX-NFA是最佳候选者，它在缺氧条件下表现出优异的缺氧敏感性和最快的PTX释放效率。然后，开发了一种结合缺氧响应性化疗和光诱导PDT的自我放大纳米制剂。

CRediT作者贡献声明

Jiahui Cong：写作 – 审稿与编辑。Ruoxue Wang：方法学。Yu Guo：软件、方法学。Yingjian Cui：方法学。Furou Lv：写作 – 原始草稿、可视化、验证、数据管理。Haijun Yu：写作 – 审稿与编辑、软件、概念化。Xiuli Hu：写作 – 审稿与编辑、软件、概念化。Shutong Lin：写作 – 审稿与编辑。Yi Lai：方法学、研究。Jianxin Rong：方法学、研究、形式分析

数据可用性

数据可根据请求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（W2412035给H.J.Y.）、上海市科学技术委员会（24430713500和23ZR1475000给H.J.Y.）的支持。国家自然科学基金（82203041和32571707给Y.L.）。所有动物实验均按照河北工业大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指南进行。