《Biomaterials》：Harnessing wireless electrical stimulation and silk-based conductive hydrogels to boost iPSC-derived astrocytes neuroprotection and guide macrophage polarisation in vitro for spinal cord repair
编辑推荐：
脊髓损伤因复杂病理生理和缺乏有效治疗手段仍是临床重大挑战。本研究报道了一种基于电荷极化诱导电容耦合的非侵入性无线电刺激平台，该平台利用丝素蛋白/PEDOT:PSS导电水凝胶实现。研究证明，该平台能在体外有效引导人iPSC来源星形胶质细胞神经保护功能、调节人血来源巨噬细胞极化，并促进PC12神经元模型突触生长，为开发脊髓修复的微创神经保护和免疫调节联合策略提供了新思路。
当一个人遭遇脊髓损伤，这不仅意味着可能终身瘫痪，还会带来感觉丧失、膀胱和肠道控制障碍以及性功能受损等一系列毁灭性后果。全世界有超过两千万人深受其害，且病例数从2013年的50万迅速增长至2019年的90万。其背后的原因错综复杂：神经元在损伤后短期内就开始大量死亡且难以再生，而作为脊髓中最丰富细胞类型的星形胶质细胞以及小胶质细胞、巨噬细胞等免疫细胞，其角色在损伤过程中动态演变，从最初的保护性转变为后期的抑制性，加剧神经炎症和胶质瘢痕形成，最终形成一个被胶质瘢痕包围的囊性空腔。传统治疗策略如干细胞移植、生长因子递送等虽有一定效果，但往往忽视了神经系统赖以生存的天然电学微环境。电刺激作为一种强大的生物物理工具，已被证明能够引导神经再生并调节炎症反应，但常规的有线电刺激方式具有侵入性，且移除电极的二次手术可能阻碍修复进程。因此，开发一种能够与柔软水凝胶平台结合、并能有效递送电刺激的非侵入性治疗策略，成为脊髓损伤修复领域亟待突破的瓶颈。
近日，一项发表在《Biomaterials》上的研究带来了创新性的解决方案。由都柏林三一学院的 Rajiv Borah 等多位学者合作，报道了一种基于电荷极化诱导电容耦合的非侵入性无线电刺激平台。该平台的核心是一种兼具优异离子/电子传导性的丝素蛋白与PEDOT:PSS复合导电水凝胶。研究人员巧妙地利用该水凝胶的电容特性，使其能够高效接收由下方铜板发射器无线传递的电信号，从而在体外对负载于其上的关键细胞进行调控，旨在为脊髓修复提供一种微创、有效的联合神经保护和免疫调节新策略。
为开展这项研究，作者运用了多个关键技术方法：首先，制备并系统表征了不同丝素蛋白浓度的可注射SF/PEDOT导电水凝胶，评估其凝胶动力学、流变学、力学性能（压缩模量）、电导率、微观结构及体外生物降解性。其次，建立了基于电容耦合原理的无线电刺激系统，使用函数发生器产生特定参数（如2 V， 10 kHz， 双相脉冲）的电信号，通过绝缘铜板非侵入性地刺激水凝胶内的细胞，并通过示波器验证信号传递效率。接着，利用人外周血单核细胞来源的巨噬细胞，研究WES对其极化状态（M1/M2表型）及炎性因子分泌的影响。最后，使用人诱导多能干细胞来源的皮层星形胶质细胞，将其封装于水凝胶中，探究长期WES或炎性因子诱导的应激状态下，WES对星形胶质细胞成熟度、活性标志物、缝隙连接蛋白表达及分泌组的影响，并进一步评估其条件培养基对巨噬细胞极化的调控作用。实验中使用的人血样本来自爱尔兰血液输注委员会提供的健康匿名捐赠者。
研究结果部分如下：
3.1. SF/PEDOT水凝胶具有临床相关的凝胶性、可注射性和电导率
研究首先证实，SF/PEDOT水凝胶能在生理温度下快速凝胶，展现出剪切稀化和良好的可注射特性，使用18G和20G针头注射时峰值力低于5 N。水凝胶的电导率约为0.3 S/m，与健康神经组织相当，并能成功点亮LED灯，证明其具备有效的电子传输能力。傅里叶变换红外光谱分析表明，随着凝胶进行，β-折叠含量增加，部分凝胶阶段具有最高的环/转角含量，这对应着更适合注射和细胞存活的柔软、半结构化状态。
3.2. 通过改变丝素浓度可调节SF/PEDOT水凝胶的机械、流变和生物降解性能
通过调整丝素蛋白浓度，水凝胶的压缩模量可在2 kPa到120 kPa之间调节。SF3/PEDOT的模量约为10 kPa，落在脊髓相关生理范围内。较低丝素浓度的水凝胶具有更高的溶胀比和孔隙率，但生物降解更快。流变学分析证实所有配方均为弹性主导，并具有触变性，能够在剪切变形后恢复结构。综合评估后，SF3/PEDOT因其适中的刚度、孔隙率、可控降解和良好的可注射性被选为后续细胞研究的最优配方。
3.3. 基于SF/PEDOT导电水凝胶的非侵入性无线电刺激系统的设计与优化
研究团队设计了一套电容耦合WES系统，通过置于培养板下方的铜板发射器产生振荡电场，经由聚苯乙烯和玻璃介质层，非侵入性地在SF/PEDOT水凝胶中感应出次级电场。电化学阻抗谱显示SF3/PEDOT在10 kHz频率下具有低电荷转移电阻和高电容性。实验证实，在含有细胞培养基的条件下，水凝胶能产生约215 mV的峰峰值电压，且信号能有效穿透离体猪肌肉组织，证明了该平台在生理环境及组织穿透场景下的可行性。
3.4. 通过SF/PEDOT水凝胶的无线电刺激调控巨噬细胞向修复表型极化
将人血来源巨噬细胞接种于水凝胶表面，在脂多糖诱导其向促炎（M1）表型极化的同时施加WES。免疫荧光和酶联免疫吸附试验结果显示，与未刺激的对照组相比，在导电的SF3/PEDOT水凝胶上接受WES的巨噬细胞，其M1标志物CD80的表达降低，而修复型（M2）标志物CD206的表达增加。同时，促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的分泌减少，抗炎细胞因子白细胞介素-10的分泌有增加趋势。这表明WES能够将炎症环境下的巨噬细胞从破坏性的M1表型向具有修复潜能的M2表型调节。
3.5. 长期无线电刺激促进iPSC来源星形胶质细胞的成熟并减轻其反应性
将人iPSC来源的皮层星形胶质细胞封装于SF3/PEDOT水凝胶中，并进行长期（两个周期）的WES。结果显示，WES显著提高了星形胶质细胞的成熟标志物胶质纤维酸性蛋白和S100β的表达，并增加了缝隙连接蛋白43斑点的密度，意味着细胞间通讯增强。在利用炎性因子诱导星形胶质细胞产生反应性（类似损伤后状态）后，WES处理能够部分抵消这种反应性，表现为反应性标志物胶质纤维酸性蛋白和腱生蛋白-C表达的降低，同时再次上调了缝隙连接蛋白43的表达，并减少了促炎因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和C-X-C基序趋化因子10的分泌。
3.6. 经WES处理的反应性星形胶质细胞条件培养基可调节巨噬细胞极化
收集经WES处理后的反应性星形胶质细胞的条件培养基，用以培养巨噬细胞。有趣的是，与未经WES处理的反应性星形胶质细胞条件培养基相比，来自WES处理组条件培养基培养的巨噬细胞，其促炎因子肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-6的分泌显著减少。这揭示了WES通过调节星形胶质细胞的分泌组，间接对巨噬细胞产生了抗炎和促修复的调控作用，展现了两种关键细胞类型在WES干预下有益的相互作用。
结论与讨论：
本研究成功开发并验证了一个集可注射导电水凝胶与电容耦合无线电刺激于一体的创新平台。该平台利用丝素蛋白/PEDOT:PSS水凝胶卓越的混合离子-电子传导性和电容特性，能够在较低频率下实现高效的非侵入性电刺激递送。
研究得出几个核心结论：第一，该WES系统能有效调节脊髓损伤微环境中两个关键细胞的行为。它能将炎症状态下的巨噬细胞从促炎的M1表型推向修复性的M2表型，并降低其促炎因子分泌。第二，它能促进iPSC来源星形胶质细胞的成熟，增强其细胞间通讯，并减轻其在炎性刺激下的反应性，同时调节其分泌组使其更有利于抗炎。第三，经WES调控的星形胶质细胞可通过旁分泌作用进一步促进巨噬细胞向修复表型转变，形成有益的细胞间对话。第四，该导电水凝胶平台本身能支持PC12神经元模型的突触生长和神经网络形成。
这项研究的意义重大。它首次系统地揭示了电荷极化诱导电容耦合的无线电刺激如何与一种微创、生物活性的导电水凝胶平台协同作用，同时调控脊髓损伤修复中至关重要的巨噬细胞和星形胶质细胞的功能。与以往需要高频率或侵入性电极的研究相比，该平台在更接近生理的频率下工作，且完全无创，临床转化潜力更高。所提出的联合神经保护和免疫调节策略，为开发针对脊髓损伤等复杂神经疾病的下一代微创修复疗法提供了强有力的理论和实验依据，展现出广阔的临床应用前景。
