《Bioorganic Chemistry》：Isoniazid-derived vanillin and Salicylaldehyde Hydrazones: Promising Antimycobacterials with KatG-dependent activation
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该研究设计合成含异烟肼（INH）及衍生物的二 hydrazone 复合物，评估抗结核活性。水杨醛基衍生物活性最佳（MIC=0.078 μg/ml），香兰素基活性稍低，可能与连接臂长度相关。所有化合物在<10 μg/ml浓度下对巨噬细胞无毒，UV-Vis证实5d在弱酸性环境稳定，提示pH触发机制不成立。对KatG突变体无效表明依赖KatG激活，为新型抗结核药物开发提供依据。
Nikita Gupta|Francoise Roquet-Baneres|Natacha Henry|Amit Anand|Pascal Roussel|Laurent Kremer|Vipan Kumar
印度旁遮普邦阿姆利则古鲁·纳纳克德夫大学化学系，邮编143005
摘要
本文设计、合成并评估了一系列由香草醛和水杨醛衍生的肼类化合物，这些化合物含有异烟肼（INH）及其类似物（烟酸肼和吡嗪-2-碳酰肼），并研究了它们的抗分枝杆菌活性。含有INH的衍生物对Mycobacterium tuberculosis（Mtb）表现出显著的活性，最低抑菌浓度（MIC）为0.078–0.625 μg/ml。基于水杨醛的肼类化合物具有最高的效力（MIC = 0.078 μg/ml），而香草醛类似物的活性略有降低，这可能是由于连接基团长度的影响。所有化合物在浓度低于10 μg/ml时对THP-1巨噬细胞均无毒性，表明其具有良好的安全性。UV–vis研究表明，基于水杨醛的肼类化合物5d在微酸性条件下稳定，表明INH在Mtb感染细胞内释放的可能性较小。此外，这些化合物对INH耐药的Mtb KatG突变体（MIC >10 μg/ml）无活性，这表明其激活机制依赖于KatG，与INH的机制类似。这些发现突显了Schiff碱二聚化在开发安全有效的抗结核药物方面的潜力，值得进一步进行化学优化。
引言
在现代医学时代，结核病（TB）仍然是最具挑战性的传染病之一，导致全球高死亡率。它主要由Mycobacterium tuberculosis（Mtb）引起，这种细菌具有抗酸性，是全球最致命的病原体之一[1]，[2]。根据世界卫生组织（WHO）的数据，2023年约有1080万人患有结核病，比2022年的1070万人略有增加。尽管如此，与结核病相关的死亡人数从2022年的132万人下降到2023年的125万人。值得注意的是，结核病再次成为单一传染病的头号致死原因，超过了COVID-19。结核病的负担分布不均，全球超过三分之二的病例集中在八个国家：印度、印度尼西亚、中国、菲律宾、巴基斯坦、尼日利亚、孟加拉国和刚果民主共和国。在这八个国家中，印度 alone 占全球病例的26%[3]。多重耐药结核病（MDR-TB）、广泛耐药结核病（XDR-TB）和完全耐药结核病（TDR-TB）的兴起，加上治疗时间的延长和患者的不依从性，给发展中国家的公共卫生、医疗系统和经济带来了沉重负担。这一令人担忧的情况凸显了改进诊断工具和更有效治疗策略的迫切需求[4]。
为应对这些挑战，WHO于2010年发布了首个针对敏感结核病的治疗指南，并在2017年和2022年进行了更新。标准六个月治疗方案包括异烟肼（INH）、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺。2022年的更新引入了额外的治疗选择，例如基于TB-PRACTECAL试验结果的BPaLM方案——包含贝达喹啉、普托曼尼德、利奈唑胺和莫西沙星。ZeNix研究还推荐了减少利奈唑胺暴露的改良BPaL方案。此外，NeXT试验和南非的项目数据探索了持续6至12个月的口服短疗程。尽管取得了这些进展，但耐药结核病的威胁仍然存在，这主要是由于药物靶点的突变、补偿性基因变化以及外排泵的激活[5]。
对抗结核病的关键策略是针对分枝杆菌细胞壁的生物合成，该细胞壁由长链β-羟基-α-烷基支链脂肪酸组成，称为分枝酸，通常含有60–90个碳原子。这种独特的结构对Mtb在巨噬细胞内的存活和复制至关重要[6]。这一途径中的一个有希望的目标是烯酰-酰基载体蛋白（ACP）还原酶（InhA），它在II型脂肪酸生物合成（FAS II）途径中起关键作用[7]。
INH是一种广泛使用的口服一线抗结核药物，以其抑制InhA的能力而闻名[8]。作为一种前药，它需要被KatG酶氧化，生成一个酰基自由基或阴离子，与NAD+形成共价加合物。这种INH–NAD复合物抑制InhA，从而阻断分枝酸的合成并导致细胞裂解[9]，[10]。大多数INH耐药性病例源于催化酶过氧化物酶KatG的突变，特别是S315T变异体，该变异体占耐药菌株的50–95%，同时保留了催化活性和毒力[11]。其他耐药机制涉及InhA（S94A、I47T、I21V）或其启动子区域的突变[12]，这些突变要么降低INH–NAD的结合亲和力，要么增加InhA的表达水平，尽管KatG突变仍然是临床菌株中耐药性的主要原因。尽管INH有效，但它与不良反应相关，如肝炎、精神症状、过敏反应和药物相互作用[13]。其亲水性限制了其在脂质生物膜中的渗透性，通常需要更高剂量，可能导致血管炎、血液学毒性和临床肝炎。此外，INH的广泛和长期使用促进了耐药Mtb菌株的出现。为了克服这些限制，人们广泛研究了INH的结构修饰。其中，含有N杂环基团的衍生物显示出特别的前景，因为它们具有广泛的生物活性，包括抗结核、抗真菌、抗癌和抗惊厥特性[14]，[15]。由于这种广泛的治疗潜力，N杂环INH衍生物继续成为开发新的抗结核药物的重点。
最近的研究在开发具有强效抗分枝杆菌活性的INH基杂化物方面取得了显著进展（图1）。值得注意的是，INH-苯磺酸盐衍生物（I）对Mtb H37Rv菌株表现出有希望的抗结核活性，最低抑菌浓度（MIC）为0.31 μM，与参考药物INH相当[16]。生物评估显示，INH-酰基肼类衍生物（II）对标准Mtb菌株表现出显著活性，MIC为0.12 μM[17]。此外，一种含有丁基间隔区和异烟肼C-5位氯取代的异烟肼-单INH杂化物（III）对Mtb菌株表现出抗分枝杆菌活性，MIC为0.34 μM[18]。1H-1,2,3-三唑连接的喹啉-异烟肼缀合物（IV）在体外对Mtb表现出高活性，MIC为0.25 μM。值得注意的是，化合物（IV）在哺乳动物细胞中高剂量下耐受性良好，显示出高选择性指数[19]。通过点击反应合成的INH-1,2,3-三唑缀合物（V）对Mtb H37Rv表现出抗结核活性，MIC为1.56 μM，尽管其活性低于INH（0.1 μM）[20]。此外，双-INH-1H-1,2,3-三唑连接的异烟肼-苯甲醛衍生物（VI）对Mtb mc26230表现出显著的抗分枝杆菌活性，MIC为0.38 μM，同时对Vero细胞的毒性较低[21]。
在本研究中，我们报告了一系列从香草醛和水杨醛衍生的双肼类杂化物的合理设计和合成，这些杂化物含有INH及其近似的杂环化合物（如图1所示）。选择香草醛和水杨醛作为醛前体，是因为它们具有多功能的芳香骨架，可以与INH形成稳定的肼键，并且具有已记录的生物活性[22]，[23]。尽管基于肼的化合物和单-INH杂化物已被研究作为抗分枝杆菌药物，但双-INH肼类结构仍相对较少被探索。结果表明，醛骨架对抗分枝杆菌活性的影响，基于水杨醛的双-INH肼类化合物比基于香草醛的化合物表现出更好的活性。
合成化学
前体2a-e和4a-e的合成过程如方案1所示。首先，将水杨醛1和香草醛3分别溶解在DMF中，然后加入K2CO3和各种二溴烷，在100 °C下反应2小时以合成2a-e和4a-e。
目标化合物的合成过程见方案2和方案3。
合成的前体2a-e和4a-e与INH、烟酸肼和吡嗪酰胺肼在微波合成器中发生缩合反应，生成Schiff碱
结论
总之，成功合成了一系列基于香草醛和水杨醛的肼类化合物，并评估了它们的抗分枝杆菌活性。含有INH的类似物对Mtb表现出显著的活性，其MIC值与标准药物INH相当。值得注意的是，来自水杨醛系列的化合物5b–5e表现出最高的效力。相比之下，含有烟酸肼或吡嗪-2-碳酰肼的类似物
CRediT作者贡献声明
Nikita Gupta：撰写原始稿件、验证、软件使用、方法学设计、数据分析。Francoise Roquet-Baneres：撰写原始稿件、方法学设计、数据分析。Natacha Henry：方法学设计、数据分析。Amit Anand：数据可视化、验证、软件使用。Pascal Roussel：项目监督、项目管理、数据分析。Laurent Kremer：撰写、审稿与编辑、验证、项目监督。Vipan Kumar：撰写、审稿与编辑、项目监督，
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：[Nikita Gupta报告称获得了印度科技部的财政支持。如果还有其他作者，他们声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。]
致谢
NG感谢DST-INSPIRE（DST/INSPIRE/03/2021/001186）的支持。AA感谢DST-FIST的支持（批准函编号SR/FST/COLLEGE-/2019/814）。LK还感谢Fondation pour la Recherche Médicale（Equipe FRM EQU202103012588）对这项项目的资助。Institut Michel Eugène Chevreul（IMEC, FR CNRS 2638）为X射线单晶设施提供了资金。
