《Biosensors and Bioelectronics》：COF-Confined CsPbBr
3 Nanocomposite with CRISPR/Cas12a-Driven DNA Walking for Ultrasensitive Electrochemiluminescent Detection of Circulating Tumor DNA
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开发了一种基于共价有机框架（COF）限定的CsPbBr3纳米材料和CRISPR/Cas12a驱动的DNA walking扩增策略的高灵敏度电化学发光（ECL）生物传感器。COF通过稳定纳米晶体、调节界面电荷转移和程序化固定DNA探针提升性能，Cas12a激活后逐步切割淬灭链恢复ECL信号，无需PCR或等温扩增。优化条件下检测限达5.4 fM，对单碱基错配选择性好，适用于稀释血清和临床血浆样本，展示了材料-酶协同策略在ctDNA检测中的潜力。
Jin Nong|Zhiyong Pan|Yucui Li|Jihua Wei|Yuanxun Gong|Jun Li|Kai Zhang|Xianjiu Liao
广西百色右江民族医学院附属医院重症医学科，533000，中国
摘要
本文开发了一种高灵敏度的电化学发光生物传感器，用于循环肿瘤DNA的检测。该传感器结合了共价有机框架和限域的CsPbBr3纳米复合材料，并采用了CRISPR/Cas12a驱动的扩增策略。共价有机框架不仅在水环境中稳定了CsPbBr3纳米晶体，还调控了界面电荷转移，并实现了DNA探针的可编程固定。当识别到目标序列时，Cas12a被激活并逐步切割表面连接的淬灭剂修饰的DNA链，从而逐步恢复电化学发光。这种表面限域的信号放大方法无需聚合酶链反应或等温预扩增。在优化条件下，该生物传感器在10 fM至10 nM的浓度范围内表现出线性响应，检测限为5.4 fM。该方法对单碱基错配具有良好的选择性，并在稀释的血清和临床血浆样本中表现出良好的性能。这些结果突显了一种材料-酶协同策略在敏感且稳健的核酸检测中的潜力，为基于电化学发光的循环肿瘤DNA分析提供了一个概念验证平台。
引言
循环肿瘤DNA（ctDNA）是在肿瘤发生过程中释放到血液中的游离DNA（cfDNA）的一部分，是非侵入性癌症诊断、预后和治疗监测的强大生物标志物。（Cai等人，2026年；Guo等人，2022年；Wang等人，2025年）在各种ctDNA生物标志物中，表皮生长因子受体（EGFR）基因的突变在非小细胞肺癌（NSCLC）中具有特别的临床意义。（Lai等人，2025年）值得注意的是，EGFR外显子21的L858R点突变是最常见的驱动突变之一，约占所有EGFR突变的40-45%，与外显子19缺失一起，占EGFR突变NSCLC病例的近90%。（Zhou等人，2023年）L858R突变的存在是预测EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗反应的公认生物标志物，当肿瘤组织不可用或不足时，基于ctDNA的EGFR L858R检测已被广泛用于临床液体活检。（Zhang等人，2024年）从分析角度来看，EGFR L858R是一个单核苷酸变异（SNV），仅与野生型序列相差一个碱基，在大量野生型cfDNA的存在下其检测难度极高。（Qing等人，2025年；Tan等人，2023年）早期和准确的ctDNA检测可以实时了解肿瘤负担和治疗反应，补充甚至替代组织活检。（Pan等人，2025年；Wang等人，2023c）传统的分析方法如数字PCR（Geng等人，2020年；Pham等人，2022年）、下一代测序（Newman等人，2014年）具有高特异性，但受到高成本、劳动密集型工作流程和较长周转时间的限制。（Das等人，2016年）此外，它们的灵敏度常常受到ctDNA极低丰度和复杂生物基质中大量野生型核酸的干扰。新兴的生物传感策略，包括电化学发光（ECL）（Qi等人，2024年；Qing等人，2025年）、荧光（Tan等人，2023年；Yang等人，2024年）、表面增强拉曼光谱（Zhou等人，2016年）和电化学测定（Shi等人，2025年）提高了灵敏度，但许多方法仍需要复杂的样品预处理，或者无法同时实现高灵敏度和操作简便性。在这些方法中，ECL传感因其低背景信号、宽动态范围和出色的可控性而脱颖而出，即使在复杂的生物环境中也能实现超灵敏检测。（Meng等人，2024年；Yao等人，2021年）因此，开发新型ECL生物传感平台对于实现快速、准确和高度选择性的ctDNA分析具有巨大潜力。
卤化铅钙钛矿纳米晶体（NCs）是一类具有通用化学式ABX3（A = Cs+，B = Pb2+，X = Cl-/Br-/I-）的半导体纳米晶体。（Li等人，2024c；Wang等人，2023a）其中，铯铅溴化物（CsPbBr3）NCs表现出优异的光致发光量子产率、窄发射带宽和可调带隙，使其成为非常有吸引力的ECL发射体。（Pu等人，2020年）尽管具有这些优势，CsPbBr3的离子晶格和不稳定的表面配体导致其在水环境中快速降解和相变，严重限制了其在生物传感中的应用。（Sun等人，2024年）已经探索了多种封装策略——如二氧化硅壳（Li等人，2019年）、聚合物基质（Fu等人，2025年）和金属-有机框架（Lai等人，2024年；Rambabu等人，2020年）来提高水稳定性（Li等人，2020年），但每种方法都有缺点，如电荷传输差、孔隙率有限或合成繁琐（Li等人，2024a）
共价有机框架（COF）是一类通过强共价键连接的结晶多孔聚合物，具有高表面积、有序的中孔通道和出色的化学稳定性。（Zhang等人，2025b；Zhang等人，2018年）它们可调的孔径和疏水微环境允许客体纳米晶体在明确定义的腔体内成核和生长。（Niu等人，2025年；Zhang等人，2025a）通过将CsPbBr3 NCs限制在COF孔内，钙钛矿NCs在空间上受到限制并受到保护，有效抑制聚集，保持光学性质，并显著提高水介质中的ECL性能（Leng等人，2023年；Li等人，2024a）。除了提高水稳定性外，COF还在改善ECL生物传感器性能方面发挥着不可或缺的作用。有序的π共轭框架促进了界面电荷转移，从而提高了ECL效率。同时，内在的孔隙率和纳米通道使得钙钛矿NCs和DNA组装在空间上受到限制，抑制聚集并增加电极界面处的局部反应物浓度。此外，化学可寻址的COF框架允许DNA支架的可编程固定，确保探针定向和控制CRISPR/Cas12a的激活。由于结构限制和电子调控的协同效应，COF作为主动的界面调节剂而非被动的稳定剂，为高性能ECL生物传感提供了坚实的基础。
规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统是细菌和古菌中的适应性免疫机制，利用CRISPR相关（Cas）核酸酶识别和切割外来核酸。（Wang等人，2023b）CRISPR家族包括多种酶，如Cas9（Moitra等人，2024年）用于位点特异性双链DNA切割，Cas13（Wei等人，2025年；Zhou等人，2020a）用于RNA靶向，以及Cas12（Li等人，2024b；Lu等人，2025）亚型用于具有附带切割活性的DNA识别。其中，Cas12a因其可编程的crRNA引导、高序列特异性和显著的“跨切割”能力而在生物传感应用中脱颖而出：一旦被互补目标激活，Cas12a会非特异性切割周围的单链DNA报告分子，从而实现强大的信号放大（Ge等人，2021年；Wang等人，2026年）。这一特性已被广泛用于构建超灵敏的核酸生物标志物检测方法，包括ctDNA、微RNA和传染性病原体，通常与等温扩增或基于纳米材料的ECL平台结合使用。将Cas12a整合到ECL传感器中，从而提供了极高的特异性和酶驱动的信号增益，使其成为本研究中开发的传感策略的关键组成部分。
DNA行走是指一类动态扩增策略，其中分子识别事件转化为沿DNA轨道或底物的逐步连续反应，从而实现信号积累，超越单一结合或切割事件。（Chen等人，2019年；Zhou等人，2020b）与传统的一步扩增相比，DNA行走提供了更高的灵敏度、固有的信号积累和更好的稳健性，通过将局部分子相互作用转化为渐进的输出。（Yan等人，2018年）迄今为止，已经报道了几种DNA行走机制，包括依赖于编程DNA轨道设计的链位移驱动行走器（Wang等人，2020年）、涉及外切酶或切割酶的酶辅助行走器（Yao等人，2019年），以及基于CRISPR附带切割的扩增系统（Yuan等人，2024年）。虽然链位移和多酶策略通常需要复杂的序列工程或严格的反应条件，但CRISPR驱动的DNA行走利用酶的切割活性作为内在驱动力。当Cas12a在电极界面受限时，其跨切割驱动的DNA行走将随机的附带切割转化为局部和准过程性反应。与传统的扩增策略（如CHA或链位移）不同，这些策略涉及独立的催化循环，这种机制将单一激活事件转化为沿多个表面连接底物的渐进切割。（Yang等人，2026年）界面限域的设计消除了对复杂DNA轨道的需求，直接将逐步的DNA去除与连续的ECL信号恢复耦合，使其特别适用于超灵敏的界面生物传感。
基于上述优势，我们报告了一个合理整合的ECL生物传感器平台，该平台利用了COF限域的CsPbBr3界面和CRISPR/Cas12a的双模活动的协同作用。在这个工程化的界面中，COF框架将铁茂（Fc）-DNA底物组织成表面限域的支架，而Cas12a通过crRNA引导的目标识别提供等位基因特异性激活。激活后，Cas12a的跨切割活性驱动沿空间组织的支架进行逐步的DNA行走过程，将分子识别转化为渐进的ECL信号恢复。通过将钙钛矿稳定、界面信号调控和CRISPR介导的特异性-扩增整合到一个连贯的系统中，这一策略克服了现有基于钙钛矿或CRISPR的ECL传感器的关键限制，实现了超灵敏和稳健的ctDNA检测。
实验部分
ECL生物传感器检测ctDNA的原理
如图1所示，所提出的生物传感器结合了COF限域的CsPbBr3 ECL发射体和CRISPR/Cas12a驱动的DNA行走扩增策略，用于超灵敏的ctDNA检测。CsPbBr3 NCs在COF的有序中孔内原位生长，其中刚性且疏水的框架提高了水稳定性，抑制了聚集，并改善了界面电荷转移，形成了一个稳健的ECL界面。Fc-DNA链固定在COF/CsPbBr3表面上，
结论
总之，开发了一种基于COF/CsPbBr3的ECL生物传感器，结合了CRISPR/Cas12a驱动的DNA行走扩增，用于超灵敏的ctDNA检测。COF框架作为主动的界面调节剂，而不仅仅是稳定的基质，同时提高了钙钛矿的水稳定性，促进了电荷转移，并在限域的电极界面内组织了DNA探针。
CRediT作者贡献声明
Kai Zhang：写作——审稿与编辑，概念构思。Xianjiu Liao：项目管理，概念构思。Zhiyong Pan：形式分析，数据管理。Jin Nong：写作——初稿，方法学，研究。Jihua Wei：验证，方法学。Yucui Li：软件，方法学，研究。Jun Li：写作——审稿与编辑，项目管理，资金获取，概念构思。Yuanxun Gong：监督，项目管理
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（82360259）、广西自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、生命科学分析化学国家重点实验室（SKLACLS2314）、广西骨与关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（21-220-06-202205）以及百色生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室的财政支持。
