针对脂质膜以阻止病毒侵入：以一种C18-烷基化的EGCG化合物为例

《Chemico-Biological Interactions》：Targeting the lipid membrane to prevent viral entry: the case of a C18-alkylated EGCG compound.

病毒依赖宿主细胞膜转运 machinery 完成生命周期，膜脂组成与结构改变可能抑制病毒入侵。本研究合成EGCG脂溶性衍生物，发现EGCG-C18最有效抑制SARS-CoV-2，通过FTIR/RMS证实其膜定位，MD模拟显示干扰GM1膜域，并验证广谱抗病毒活性。

　　

Cristina Minnelli | Sara Caucci | Roberta Galeazzi | Emiliano Laudadio | Elena Romagnoli | Andrea Frontini | Loredana Rao | Valentina Notarstefano | Tatiana Armeni | Brenda Romaldi | Stefano Menzo | Giovanna Mobbili

马尔凯理工大学生命与环境科学系，意大利安科纳60131

摘要

1. 病毒在其生命周期的大部分阶段都依赖于宿主细胞膜的运输机制，包括病毒进入、组装和免疫逃逸。因此，膜脂质组成和结构的改变可能会影响病毒对宿主细胞的侵袭。在这项研究中，我们合成了一系列表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）的亲脂衍生物，并在体外模型中评估了它们对SARS-CoV-2的抑制活性。其中，通过区域选择性烷基化天然多酚获得的EGCG-C18（4′′-十八烷基EGCG衍生物）被证明是最有前景的候选药物。我们使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）和拉曼显微光谱（RMS）检测了EGCG-C18在细胞膜中的定位，并通过分子动力学（MD）模拟、流式细胞术和共聚焦显微镜研究了其与单唾液酸四己糖苷（GM1）的相互作用。GM1是一种存在于质膜特定微域（称为脂质筏）中的糖鞘脂。EGCG-C18似乎通过直接干扰GM1的结构来阻止病毒进入细胞。此外，我们还发现EGCG-C18能够降低EGFR的活性，这表明该化合物可能具有其他潜在作用。最后，我们测试了EGCG-C18对单纯疱疹病毒、B型流感和HIV-1的抗病毒效果，以验证其广谱抗病毒活性的假设，这可能是由于其能够重组脂质筏成分。

引言

针对SARS-CoV-2的膜靶向疗法通过调节宿主细胞质膜的物理化学性质，从而干扰病毒与细胞的相互作用和进入过程，成为传统抗病毒策略的一种有前景的替代方案[1]。许多病毒与宿主细胞的初次接触发生在质膜层面，膜的排列和脂质组成对受体可及性和病毒附着至关重要。富含胆固醇和鞘脂的膜微域（通常称为脂质筏）有助于膜的横向组织，并可作为促进病毒结合和内化的动态平台[2]、[3]、[4]。脂质筏被认为可以促进病毒受体和共受体的聚集，从而提高有包膜和无包膜病毒的感染效率。例如，SARS-CoV和SARS-CoV-2进入宿主细胞的早期步骤涉及其刺突（S）糖蛋白与血管紧张素转换酶2（ACE2）的结合[5]、[6]。同样，HIV-1的进入[7]也涉及病毒gp120与CD4及共受体CCR5和CXCR4的相互作用，而这些受体的信号传导和膜组织受到富含胆固醇的域的调控[8]、[9]、[10]。据报道，人类疱疹病毒6型（HHV-6）也能通过将其细胞受体CD46招募到脂质筏丰富的区域来利用膜微域的重排[11]、[12]、[13]、[14]。多项实验和计算研究表明，病毒进入过程经常涉及对特定糖鞘脂（如GM1）的识别，而GM1与病毒的相互作用有助于后续的受体结合和内化，从而促进高效感染[7]、[15]、[16]、[18]。基于这一概念，能够诱导脂质筏或GM1扰动的物质[19]有望干扰有包膜病毒（包括SARS-CoV-2）的初始结合位点、激活、内化和细胞间传播[20]、[21]、[22]；例如，甲基-β-环糊精等物质由于其特殊的形状（能够通过形成包合物来结合胆固醇）而具有抗病毒作用[23]。研究表明，在Vero E6（非洲绿猴肾细胞）中去除胆固醇可使伪型SARS-CoV的感染性降低90%，因为这会改变ACE2在非脂质筏环境中的分布[24]。

两亲性化合物特别适合调节膜结构，因为它们可以通过与疏水性和亲水性环境的相互作用插入脂质双层[25]。通过改变脂质排列和膜秩序，这类化合物可能间接影响脂质筏的大小、稳定性和功能特性，最终干扰与这些域相关的信号通路和蛋白质定位[26]。绿茶中最丰富的多酚表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）因其对多种病毒（包括冠状病毒）的抗病毒活性而受到广泛关注。虽然EGCG主要通过结合病毒表面的刺突蛋白来阻止病毒附着和进入宿主细胞[27]，但也有证据表明其具有预防作用，这可能部分与其与膜脂质的相互作用有关。研究表明EGCG以非均匀的方式与细胞表面结合，优先分布在富含脂质筏的膜部分[28]。EGCG进入细胞膜后可能会改变脂质秩序，从而破坏与病毒内化相关的过程[29]。基于这些观察结果，我们合成了一系列亲脂EGCG衍生物以增强母体化合物与膜脂质双层的相互作用。为了进一步研究潜在的膜靶向抗病毒化合物的结构要求，我们还制备了Edaravone-C18和Epicatechin-C18。我们在Vero E6细胞中评估了这些化合物的抗病毒活性，发现EGCG-C18是最有效的分子。傅里叶变换红外光谱和拉曼显微光谱（FTIR和RMS）证实了EGCG-C18能够直接与脂质双层相互作用。

由于膜结构对膜相关受体的活性具有关键调节作用，我们研究了EGCG-C18对表皮生长因子受体（EGFR）表达和活性的影响，作为膜扰动的功能指标。同时，利用分子动力学模拟、流式细胞术和共聚焦显微镜研究了EGCG-C18对GM1（一种富含脂质筏微域的糖鞘脂）的影响，GM1是病毒进入过程中涉及的脂质域改变的指示物。最后，基于膜靶向药物可以通过破坏病毒感染的共同过程（如膜融合和细胞进入）来对抗不同病毒感染（不同于针对病毒特异性靶点）的假设，我们测试了EGCG-C18对单纯疱疹病毒、B型流感和HIV-1的抗病毒效果。

药物选择和合成的理由

先前的研究[27]、[30]表明，EGCG的抗病毒活性主要归因于其与病毒刺突（S）蛋白的受体结合域（RBD）的结合能力，从而阻止病毒与宿主细胞上的ACE2受体相互作用。然而，也观察到其较弱的抗病毒效果，这可能是由于多酚与RBD结合上游的细胞膜相互作用所致[31]；实验证据表明……

结论

在这项研究中，我们合成了一系列EGCG的亲脂衍生物。这些两亲性分子是通过在EGCG骨架上引入不同长度（6、10和18个碳原子）的饱和碳链，并通过醚键连接的。我们添加了Eda-C18和Epicatechin-C18来研究药物的亲水部分对阻止病毒进入的影响。这些化合物的治疗潜力通过抑制SARS-CoV-2进行了评估。

合成程序

合成过程中使用的材料和试剂均购自Sigma Aldrich公司（德国Stenheim），使用前未经纯化。所有溶剂均为分析纯，并在使用前进行了干燥。薄层色谱（TLC）是在预先涂有硅胶60 F254（Merck）的铝板上进行的。柱色谱使用硅胶60（230–400目）进行。高分辨率质谱（HRMS）ESI分析是在Xevo G2-XSQTof（Waters）质谱仪上进行的。

CRediT作者贡献声明

Andrea Frontini：撰写 – 原稿撰写、资源提供、方法学设计。Elena Romagnoli：实验研究。Valentina Notarstefano：数据可视化、方法学设计、实验研究。Loredana Rao：实验研究。Brenda Romaldi：实验研究、数据管理。Giovanna Mobbili：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、监督、方法学设计、概念构思。Tatiana Armeni：撰写 – 审稿与编辑、监督。Cristina Minnelli：撰写 – 原稿撰写、可视化、方法学设计。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。