《Dyes and Pigments》：Site-specific photosensitizer conjugation and anti-viral application of protein targeting SARS-CoV-2
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靶向SARS-CoV-2 Spike-RBD的微型蛋白LCB1与四苯基卟啉光敏剂CPZ通过Sortase酶介导的模块化共价连接，形成具有广谱抗病毒活性和精准时空可控性的新型光动力疗法。体外实验表明，该复合物10 nM浓度即可完全阻断ACE2过表达细胞对SARS-CoV-2伪病毒感染，光激活后1 nM浓度即可清除60%的细胞内病毒，为应对高变异病毒提供了可快速迭代的新型治疗策略。
姜云斌|邹成|朱思瑞|方晓宇|张晓|周小蕾|黄明东
中国福建省漳州市363000，闽南师范大学生物科学与生物技术学院
摘要
高度变异的病毒（例如SARS-CoV-2）能够快速发生突变逃逸，这要求我们开发出兼具广谱活性和快速适应性的创新治疗策略。光动力疗法（PDT）因其具有泛抗病毒活性和时空可控性，成为克服耐药性限制的一种有前景的技术。本文提出了一种模块化的位点特异性共价 conjugation 方法，将酞菁光敏剂（CPZ）与靶向SARS-CoV-2刺突受体结合域（Spike-RBD）的微蛋白LCB1结合在一起，解决了光敏剂通常具有疏水性这一难题。该过程在温和的水性条件下通过转肽酶Sortase催化完成，最终得到了双功能结合物LCB1-CPZ。体外实验表明，10 nM浓度的LCB1-CPZ即可完全阻断在血管紧张素转换酶2（ACE2）过表达的293T细胞中的SARS-CoV-2伪病毒感染。此外，在光照激活下，仅1 nM浓度的LCB1-CPZ就能实现60%的病毒抑制率。这种“靶向并中和”的分子设计范式为应对新兴病毒大流行提供了快速部署的解决方案，其模块化特性使其能够迅速适应新变种的抗原漂移。
引言
高度变异的病毒（如SARS-CoV-2和甲型流感病毒）通过抗原漂移、基因重组或超突变机制持续逃避宿主免疫和治疗效果，对全球公共卫生系统构成持续威胁。以SARS-CoV-2为例，该病毒利用其刺突糖蛋白通过宿主细胞上的血管紧张素转换酶2（ACE2）受体进行感染[1]。刺突蛋白的快速突变导致疫苗诱导的中和效力显著下降[2]。同时，小分子药物由于依赖单一靶点且平均研发周期为4-6年，无法跟上病毒的进化速度[3]。更为严峻的是，病毒的多器官侵袭性（例如SARS-CoV-2可感染多个器官系统[4]）要求抗病毒技术具备广谱活性、组织穿透性和低宿主毒性。这一挑战迫切需要开发出能够快速适应病毒突变的同时实现精准治疗效果的新治疗策略。
光动力疗法（PDT）作为一种新型非侵入性治疗方法，利用特定波长的光激活光敏剂生成活性氧（ROS），从而非特异性地氧化并破坏病毒包膜或核酸结构[5]。与传统抗病毒方法相比，PDT具有三大优势[5][6][7]：（1）广谱抗病毒潜力：通过靶向进化保守的病毒成分（如脂质双层或核酸二级结构），可规避由单一蛋白质突变引起的耐药性；（2）快速响应和时空精确性：局部喷洒光敏剂并结合便携式LED光源可实现病毒灭活，满足早期控制的迫切需求；（3）优异的安全性：人类宿主细胞通过多层多靶点酶类抗氧化防御系统（如超氧化物歧化酶SOD和谷胱甘肽过氧化物酶GPx）具备强大的ROS清除能力，而病毒缺乏自主代谢途径和保护系统，因此在富含ROS的环境中极易受到氧化损伤。此外，PDT是一种局部治疗技术，通过靶向光照激活可减少全身副作用。
本研究提出了一种基于转肽酶Sortase的模块化 conjugation 方法，以快速开发靶向光敏剂。在温和的水性条件下，我们利用Sortase的酶学特异性，将靶向SARS-CoV-2刺突受体结合域（Spike-RBD）的微蛋白LCB1与含有单取代羧基的酞菁光敏剂（2-羧基酞菁锌CPZ）共价连接，合成了双功能结合物LCB1-CPZ。该结合物保留了Spike-RBD的结合能力，能够抑制SARS-CoV-2对HEK293T-ACE2细胞的感染。有趣的是，该结合物还能清除细胞内的病毒。这一策略可以快速便捷地合成与蛋白质靶向剂结合的光敏剂，为预防和治疗高度变异病毒提供有效药物开发策略，并可作为应对病毒大流行的技术储备。
实验部分
质粒、细菌、细胞和伪病毒
为了构建靶向SARS-CoV-2 Spike-RBD的LCB1-CPZ结合物，我们将含有转肽酶Sortase识别基序（LPETG）和His标签（8?His）的C端模块肽（LPETGH8）与微蛋白LCB1进行基因融合（图1A）。编码该结构的DNA序列经过针对大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统的密码子优化，并克隆到pET-22b(+)载体中，得到质粒pET-22b-LCB1-St-His（GenScript Biotech）。随后对该质粒进行了...
GGGSKS肽的共价结合提高了CPZ的水溶性和单体分散性
工程化的微蛋白LCB1使用大肠杆菌BL21(DE3)表达。SEC纯化曲线显示LCB1的分子量为8.6 kDa（图2A），保留体积为14.46 mL，与SDS-PAGE分析结果一致，表明LCB1表达成功且纯度较高，适合后续功能研究。
光敏剂衍生物GGGSK(-S)-CPZ是通过共价连接方式合成的...
讨论
在本研究中，我们合成了一种在LCB1 C端通过GGGSKS肽精确共价连接的光敏剂LCB1-CPZ，这是一种针对SARS-CoV-2 Spike-RBD的靶向光动力剂。这种共价结合不仅提高了光敏剂的水溶性。需要指出的是，像酞菁这样的光敏剂由于通常含有较大的芳香环结构，其共价结合过程面临较大挑战...
CRediT作者贡献声明
姜云斌：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，资金获取，数据分析。
朱思瑞：数据分析，实验研究。
方晓宇：数据分析，实验研究。
张晓：数据分析，实验研究。
邹成：撰写 – 初稿，实验研究，数据分析。
周小蕾：撰写 – 审稿与编辑，数据分析。
黄明东：撰写 – 审稿与编辑，资源协调，项目管理，方法设计，概念构思
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的情况
在撰写过程中，作者使用了DeepSeek工具来提升手稿的可读性和语言表达。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本项工作得到了中国福建省自然科学基金[2022J05175]、福建省中青年教师教育与研究项目[JAT210262]以及闽南师范大学校长基金[KJ2020014]的支持。
