《International Journal of Biological Macromolecules》：SOX9 protein in goblet cells as a critical mediator and potential therapeutic target in Barrett's esophagus: An integrated bioinformatics analysis
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Barrett's食管多组学分析揭示SOX9等新型诊断标志物及免疫微环境特征，为早期检测和靶向治疗提供依据。
林阳|邓静静|孔德淼|刘馨欣|李翔|郭万凯|徐传|韩连奎|周建峰
中国贵州省人民医院胸外科，国家肺免疫疾病重点实验室，贵阳，550002
摘要
背景
巴雷特食管（BE）是已知的食管腺癌唯一的前体病变，但目前的诊断和治疗策略仍受到采样偏差和缺乏可靠分子标志物的限制。
方法
我们使用四个批量RNA-seq数据集进行了多组学分析，以检测差异表达和WGCNA。通过PPI网络和LASSO回归识别枢纽基因，并在外部队列中进行了验证。scRNA-seq用于分析上皮和基质亚型的基因表达，同时通过CIBERSORT进行免疫谱分析。在巴雷特食管患者队列中验证了SOX9的单细胞表达。
结果
五种上调蛋白——SOX9、COL1A2、SPARC、EPCAM和KRT18——被确定为稳健的诊断标志物，其AUC值大于0.90。scRNA-seq显示巴雷特食管中的杯状细胞SOX9表达增加，这一点通过IHC得到了验证。SOX9在杯状细胞中的表达与高级别异型增生（HGD）的进展相关，而在非杯状细胞中的表达相关性较低。巴雷特食管组织显示出独特的免疫特征，血浆细胞和CD4+记忆T细胞富集。分子对接发现了与这些蛋白潜在的相互作用位点。
结论
我们的综合分析提供了巴雷特食管的全面分子和细胞图谱。这些发现加深了对巴雷特食管发病机制的理解，并为早期检测和靶向干预提供了具有临床意义的候选分子。
引言
巴雷特食管（BE）是一种病理状态，其中食管远端的正常分层鳞状上皮被化生性柱状上皮所替代，通常是由慢性胃食管反流病（GERD）引起的[1]、[2]、[3]。这种化生性转变显著增加了患食管腺癌（EAC）的风险，而食管腺癌是一种致命性恶性肿瘤，其发病率在西方国家近几十年来急剧上升[4]、[5]、[6]。尽管BE本身不是恶性肿瘤，但它被认为是EAC唯一明确的癌前病变，其发展顺序是从非异型增生到低级别和高级别异型增生，最终发展为浸润性癌。早期识别BE及其进展风险的分层对于预防EAC相关死亡至关重要。
目前，BE的诊断和监测主要依赖于内镜评估和组织学分析，这两种方法都具有侵入性，且常常受到采样误差和主观解释的限制。此外，虽然已经研究了一些BE的分子特征——如TP53、CDKN2A的异常和DNA含量异常——但这些标志物单独使用时缺乏足够的敏感性和特异性，无法用于临床应用[7]、[8]。因此，迫切需要阐明能够区分BE和正常食管上皮（NE）的稳健分子生物标志物，并理想地预测进展风险。
高通量转录组分析为全面解析BE的分子景观提供了有力策略。然而，大多数先前的研究受到样本量小、缺乏验证队列以及依赖单一维度分析方法（如仅使用差异表达分析）的限制[9]。这些限制阻碍了可重复生物标志物的识别和更深入的机制理解。此外，尽管批量RNA-seq数据具有信息价值，但可能会掩盖对疾病发病机制至关重要的细胞类型特异性表达模式。单细胞RNA测序（scRNA-seq）、免疫谱分析和多数据集验证的结合为克服这些限制并系统地识别参与BE发展的关键分子驱动因素和细胞群体提供了机会[10]、[11]。
在这项研究中，我们采用了一种多组学整合方法来识别新的分子标志物和潜在的治疗靶点。我们首先分析了四个独立的基因表达组（GEO）数据集，以识别BE和NE组织之间的差异表达基因（DEGs）。为了进一步确定功能相关的基因集，我们进行了加权基因共表达网络分析（WGCNA），以识别与BE表型显著相关的模块。然后通过整合DEG、WGCNA和GeneCards数据识别候选枢纽基因，接着构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并进行拓扑分析。应用机器学习模型，特别是最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归，在训练数据和外部验证数据集中细化和验证关键诊断生物标志物。为了补充批量转录组的结果，我们利用公开可用的巴雷特食管和正常食管样本的scRNA-seq数据，在单细胞水平和特定细胞亚型中评估了枢纽基因的表达。鉴于越来越多的证据表明免疫微环境在BE的发病机制和进展中起作用，我们还使用CIBERSORT算法进行了免疫浸润分析。此外，我们对SOX9和MUC2进行了免疫荧光染色，以评估SOX9表达（在杯状细胞或非杯状细胞中）与BE进展之间的相关性。最后，重点关注排名最高的枢纽基因SOX9，进行了药物重定位和分子对接分析，以探索具有治疗相关性的潜在小分子抑制剂。总体而言，本研究提出了一个综合的生物信息学流程，整合了转录组、单细胞、免疫学和结构药理学数据，以识别BE的关键分子决定因素。我们的发现为理解BE的分子机制提供了新的见解，并为开发新的生物标志物和靶向疗法奠定了基础，旨在提高早期检测和疾病干预的效果。
患者
本研究包括两个独立的临床队列。第一个队列由23名被诊断为巴雷特食管（BE）的患者组成，他们通过内镜监测进行了纵向随访。该队列根据临床进展分为：无进展、进展为低级别异型增生（LGD）和进展为高级别异型增生（HGD）。每个组的详细基线人口统计和临床信息，包括年龄和平均随访期，在
识别与BE相关的DEGs
从GEO数据库中检索了GSE36223和GSE39491的数据。原始信号经过背景校正、标准化，并使用R包中的rma函数计算表达谱。我们执行normalizeBetweenArrays函数来标准化样本偏差（图S1A）和Combat函数来减轻批量效应（图S1C）。结果，主成分分析（PCA）表明BE和NE样本可以分开（图S1D）。DEGs分析
讨论
BE是一种癌前病变，其特征是食管远端的正常鳞状上皮被柱状上皮替代，通常是由慢性胃食管反流引起的[17]。尽管BE显著增加了患EAC的风险，但其分子基础仍不完全清楚[18]。在这项研究中，我们结合了批量RNA微阵列、scRNA-seq、免疫去卷积和药物靶点相互作用建模进行了综合转录组分析
CRediT作者贡献声明
林阳：撰写——原始草稿，可视化，概念化。邓静静：撰写——原始草稿，可视化，概念化。孔德淼：撰写——原始草稿，可视化，概念化。刘馨欣：撰写——审稿与编辑，数据管理。李翔：撰写——审稿与编辑，数据管理。郭万凯：撰写——审稿与编辑，数据管理。徐传：撰写——审稿与编辑，数据管理。韩连奎：撰写——审稿与编辑，监督，
伦理声明
本研究遵循赫尔辛基宣言进行，并得到了四川大学 West China 医院伦理委员会（IRB）的批准（2020(1094）。
资助
本工作得到了贵州省人民医院人才基金（[2024]-26和贵州遗传基金会-ZK[2022] General 251的资助。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
