加热灭活的Leishmnaia donovani疫苗与Toll样受体7/8激动剂联合使用后在BALB/c小鼠中的保护效力

《International Journal of Biological Macromolecules》：Protective efficacy of heat-killed Leishmnaia donovani vaccine adjuvanted with Toll Like Receptor 7/8 agonist in BALB/c mice

该研究首次报道合成TLR7/8激动剂p-AM-BBIQ与灭活Leishmania donovani抗原（HKA）联用在小鼠模型中对 visceral leishmaniasis的免疫治疗潜力，显著降低脾脏寄生虫负荷，增强NO/ROS产生及Th1相关细胞因子（IFN-γ、TNF-α）表达，同时抑制Th2和调节性细胞因子（IL-10、IL-13、IL-27），证实其作为疫苗佐剂的潜力。

　　

希瓦尼·塔库尔（Shivani Thakur）| 桑迪普·考尔（Sandeep Kaur）| 迪彭德·考希克（Deepender Kaushik）| 库什温德·库马尔（Kushvinder Kumar）| 迪帕克·B·萨伦克（Deepak B. Salunke）| 苏克比尔·考尔（Sukhbir Kaur）

印度昌迪加尔旁遮普大学动物学系寄生虫学实验室，邮编160014

摘要

内脏利什曼病（Visceral Leishmaniasis）由原生动物寄生虫Leishmania donovani引起，是一种极具威胁性的被忽视的热带疾病，目前尚无获批的人类疫苗，且化疗药物的抗药性风险日益增加。现有的疫苗研发方法受到免疫原性不足的制约，这凸显了开发能够引发持久保护性免疫反应的强效佐剂的必要性。本文首次报道了一种合成TLR7/8激动剂1-(4-(氨基甲基)苯基)-2-丁基-1H-咪唑[4,5-c]喹啉-4-胺二盐酸盐（p-AM-BBIQ）与热灭活的L. donovani抗原（HKA）联合使用的免疫治疗潜力。接受该佐剂免疫的小鼠脾脏中的寄生虫负荷显著减少，同时一氧化氮和活性氧的产生也有所增强。转录组分析显示iNOS和Nf-κB的表达上调，表明先天免疫反应被激活。流式细胞术分析显示脾脏细胞中CD4⁺和CD8⁺ T细胞的频率增加，血清细胞因子分析显示Th1相关细胞因子（IFN-γ和TNF-α）升高，而Th2相关细胞因子（IL-10和IL-13）及调节性细胞因子IL-27降低。这些发现表明p-AM-BBIQ能够增强先天性和适应性免疫反应，为其作为TLR7/8靶向佐剂、提升疫苗对内脏利什曼病及其他需要强Th1免疫的细胞内感染的疗效提供了理论依据。

引言

利什曼病是一种由Leishmania寄生虫引起的媒介传播疾病，这种寄生虫会感染宿主的单核吞噬细胞，并在沙蝇体内以裂殖体形式存在，在宿主细胞内转化为无鞭毛体[1]。全球约有10亿人面临感染风险，每年新增病例达170万例[2]。传播该寄生虫的主要媒介是采血沙蝇。在生命周期中，Leishmania在沙蝇体内以裂殖体形式存在，在宿主巨噬细胞内则以无鞭毛体形式存在。临床上，利什曼病表现为皮肤型（CL）、黏膜皮肤型（MCL）和内脏型（VL），具体类型取决于寄生虫种类和宿主免疫反应[3]。最严重的形式是内脏利什曼病（VL），若不治疗可能会致命，因为寄生虫会侵袭淋巴结、肝脏和骨髓等器官。宿主免疫反应对疾病的结局和治疗效果至关重要。保护性免疫涉及IFN-γ驱动的巨噬细胞激活和一氧化氮（NO）的产生，而抗炎反应则可能促进疾病进展[4]。

为解决抗原呈递效果差、系统性毒性、药物疗效低、巨噬细胞内药物浓度不足以及治疗成本高等问题，疫苗接种可能是最有希望的解决方案[5]。虽然某些针对犬类利什曼病（CanL）的蛋白质疫苗已在部分地区上市，但目前尚无获批的人类内脏利什曼病疫苗[6]，但这种可能性是存在的，因为无论是自然康复还是通过药物治疗的患者都能产生对再次感染的免疫力[7]。

第一代疫苗利用全灭活的Leishmania在动物模型中显示出部分疗效，但人类疫苗仍未问世。通常需要合适的佐剂来辅助免疫反应，因为单独使用灭活抗原无法引发持久免疫力[8][9]。

新的疫苗策略应基于对先天免疫反应的最新认识，特别是病原体相关分子模式（PAMPs）激活Toll样受体（TLRs）的作用机制，因为这有助于形成适应性免疫。TLR7/8激动剂通过促进IFN-γ、IL-12和CD4⁺/CD8⁺ T细胞活性以及一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的产生来增强Th1偏向的免疫反应，从而帮助清除寄生虫[10]。然而，不同物种的TLR反应性存在差异，需要予以考虑：人类TLR8可被咪唑喹啉类配体有效激活，而小鼠的TLR8反应较弱，小鼠的主要传感器是TLR7[11]。因此，开发能够同时有效激活TLR7和TLR8的佐剂系统仍是一个关键挑战，以促进针对Leishmania donovaniLeishmania

在现有激动剂中，p-AM-BBIQ是一种高效的双重TLR7/8激动剂，其活性优于传统的R848等佐剂，因此是评估其与热灭活（HK）L. donovani联合使用的理想选择。这种配方有望最大化抗原特异性细胞反应和一氧化氮/活性氧介导的寄生虫清除效果，弥补了以往疫苗方法的局限性。

基于这些研究结果，我们制备了一种将HK L. donovani抗原与p-AM-BBIQ结合的疫苗[14]。根据OECD指南对合成新化合物的急性毒性要求，对p-AM-BBIQ在BALB/c小鼠体内的剂量进行了优化，以确保接种前的安全性。我们假设联合使用HK L. donovani抗原和p-AM-BBIQ可通过TLR7/8介导的免疫反应增强T细胞依赖性免疫，从而提高寄生虫清除效果和长期保护作用。因此，本研究旨在通过评估寄生虫负荷减少情况、CD4⁺和CD8⁺ T细胞频率、活性氧和一氧化氮的产生以及免疫调节基因（iNOS和NF-κB）的表达，来评估该疫苗的免疫原性和保护效果。

动物与伦理许可

本研究使用了体重20-25克的BALB/c雌性小鼠，这些小鼠来自昌迪加尔旁遮普大学中央动物房。动物生活在标准实验室条件下（温度22±2°C，12小时光照/黑暗周期），并可自由摄取食物颗粒和水。所有实验操作均获得了昌迪加尔旁遮普大学动物伦理委员会（PU/45/99/CPCSEA/IAEC/202.1/546）的批准。

寄生虫培养

L. donovani裂殖体（MHOM/IN/80/DD8）

接种p-AM-BBIQ佐剂与热灭活抗原联合疫苗的小鼠中寄生虫负荷的减少

在8周和16周时评估寄生虫负荷发现，联合使用p-AM-BBIQ和HK抗原显著提高了寄生虫清除效果，其中中等剂量下的效果最为显著（图1）。在8周时，对照组小鼠的寄生虫负荷较高（680,000±0.6个寄生虫/10⁶个细胞），而HKA组（340,000±0.5个寄生虫/10⁶个细胞）（p<0.001 vs 对照组）和HK+R组（270,000±0.4个寄生虫/10⁶个细胞）（p<0.001 vs 对照组和HKA组）的寄生虫负荷也显著降低，其中HK+p-AM-BBIQ组的寄生虫负荷最低

讨论

内脏利什曼病仍然是南美洲、东非和南亚等流行地区的重大公共卫生问题。目前的治疗方法如锑剂、两性霉素B和米替福辛受到高成本、治疗周期长、毒性和药物耐药性的严重限制。此外，在免疫功能低下的共感染患者中更容易复发[35]。这些挑战凸显了迫切需要长期预防策略

结论

本研究表明，基于咪唑喹啉的TLR7/8激动剂p-AM-BBIQ与HK L. donovani抗原联合使用具有强大的免疫预防作用。观察到的Th1偏向性细胞因子谱表明CD4⁺ T细胞比例增加，这可能促进了IFN-γ和TNF-α的产生，并抑制了Th2及相关调节性细胞因子（IL-10、IL-13和IL-27），最终显著降低了脾脏中的寄生虫负荷。从机制上看

作者贡献声明

希瓦尼·塔库尔（Shivani Thakur）：撰写初稿、验证、方法论设计、数据整理、概念构思。桑迪普·考尔（Sandeep Kaur）：数据可视化、验证、方法论设计、实验研究。迪彭德·考希克（Deepender Kaushik）：数据可视化、验证、方法论设计、实验研究。库什温德·库马尔（Kushvinder Kumar）：数据可视化、验证、方法论设计、实验研究。迪帕克·B·萨伦克（Deepak B. Salunke）：撰写修订稿、数据可视化、资源管理、方法论设计、实验研究、数据分析、概念构思。苏克比尔·考尔（Sukhbir Kaur）：撰写修订稿

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

作者声明本手稿中未使用AI生成的内容。

未引用参考文献

[39]

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系

致谢

作者感谢印度昌迪加尔旁遮普大学动物学系提供的实验室设施和研究条件，这些资源对于本研究的成功实施至关重要。本研究得到了科学与工业研究委员会（CSIR）的资助，具体项目编号为CSIR-JRF/SRF Fellowship Award No. [09/135(0834)/2019-EMR-I，以及印度医学研究委员会（ICMR，新德里）的资助（项目编号[6/9-7(299)/2022-ECD-II），属于ICMR的特别计划。