《International Journal of Biological Macromolecules》：Distinctive scaffoldin proteins in
Ruminococcoides bili FMB-CY1 and their roles in amylosome
编辑推荐：
研究通过删除热栖菌HB27漆酶（TthMCO）的β-发夹环设计两个突变体（Δ1和Δ2），结合晶体学、动力学及pH分析，发现β-发夹环通过调节T1Cu位点溶剂可及性影响催化效率和pH活性范围，删除后扩展pH活性窗口但降低反应速率，揭示了该结构域在平衡底物可及性与电子转移效率中的关键作用。
Leticia León-Luna | Paloma Gil-Rodríguez | Enrique Rudi?o-Pi?era
墨西哥国立自治大学（UNAM）生物技术研究所，分子医学与生物过程系，结构生物化学实验室，莫雷洛斯州
摘要
漆酶是一类多铜氧化酶，在多个行业中发挥着多种功能。来自Thermus thermophilus菌株HB27（TthMCO）的漆酶是一种热稳定酶，其特征是含有丰富的甲硫氨酸基序，这一基序被认为是Thermus、Meiothermus和Aquifex属漆酶的独特结构特征。在< />MCO和Aquifex aeolicus的多铜氧化酶（McoA）中，这一基序部分阻断了T1铜位点的溶剂可及性（PDB编号分别为2XU9和6SYY）。这种结构特征——即< />MCO中的β-发夹结构——被认为会影响该酶的催化活性及其对pH值的依赖性。为填补这一知识空白，我们生成了两种缺失突变体：?1，去除了最灵活的区域（B值>12 ?2）；?2则完全去除了β-发夹结构，以模拟真菌漆酶的架构。这种策略使我们能够直接比较这两种突变体的结构完整性、催化参数及pH依赖性活性，同时保持其整体结构。这项工作首次系统地结合了晶体学、动力学分析和pH值测定方法，用于研究< />MCO的β-发夹缺失突变体。研究结果表明，去除β-发夹结构扩大了酶的pH活性范围并提高了Km值，尽管这对整体反应速率产生了负面影响。这些发现揭示了β-发夹结构在平衡底物可及性与电子转移效率方面的重要性，为合理设计与< />MCO相关的细菌漆酶提供了重要见解。
引言
漆酶（EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶（MCO）家族，这是目前已知最大的蓝铜氧化酶亚群[1]。这类酶利用铜离子的氧化还原性质来催化各种底物的氧化，并同时将分子氧还原为水[2]。根据底物特异性，MCO可分为高特异性和低特异性两类[3]。漆酶属于低特异性MCO，能够氧化多种有机分子，在植物[4]、真菌[5]和细菌[6]的多种生理过程中发挥重要作用。然而，植物和细菌漆酶的催化效率通常较低，主要是因为它们的氧化还原电位较低，这限制了它们从底物中获取电子的能力，尤其是在与真菌漆酶相比时[7]。无论来源是细菌还是真菌，MCO在其三维结构中都具有保守的三结构域铜氧化还原蛋白型折叠[8]、[9]、[10]。催化核心由十个组氨酸残基和一个半胱氨酸残基组成，它们在四个不同位点协调四个铜离子[11]。T1铜位点（T1Cu）由两个组氨酸和一个半胱氨酸协调，控制底物的氧化过程，并显著影响酶的氧化还原电位，真菌漆酶的氧化还原电位可高达790 mV，而细菌漆酶的氧化还原电位约为310 mV[12]。T1Cu位点的底物氧化通过外层电子转移机制进行，而非依赖底物与活性位点之间的结构互补性[2]、[3]、[13]、[14]。随后，电子通过保守的Cys-His桥传递到三核中心（TNC），该中心包含一个T2铜离子（T2Cu）和两个T3铜离子（T3Cu和T3’Cu），在溶剂提供的质子辅助下将分子氧还原为水[3]、[15]。虽然真菌漆酶在多种芳香族和酚类底物上的氧化还原电位及催化效率较高[16]、[17]，但它们在极端pH值或温度条件下稳定性较差，活性也会降低[18]。相比之下，细菌漆酶具有多项优势：它们更容易克隆和异源表达，生产速度快且成本低廉，底物特异性也更强[19]。重要的是，它们在广泛的pH值和温度范围内具有出色的操作稳定性，并且能够抵抗溶剂、洗涤剂和重金属的抑制[20]。这些特性使得细菌漆酶特别适合需要能够在恶劣环境或化学条件下工作的生物催化剂的应用[21]。尽管如此，真菌漆酶仍是高潜力氧化反应的标杆酶，这突显了两者之间的互补优势和权衡[17]。鉴于这些差异，大量研究致力于寻找和开发兼具高氧化还原电位和增强物理化学稳定性的漆酶[22]、[23]。在这方面，Miyazaki[24]首次报道了来自超嗜热菌Thermus thermophilus HB27（TthMCO）的漆酶，该菌的最佳生长温度为68°C，最高存活温度可达85°C。这种酶在2,2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）作为底物时表现出最佳活性，半衰期为14小时，是目前已知最耐热的MCO酶之一[25]。TthMCO在T1Cu位点腔入口处具有独特的富含甲硫氨酸的β-发夹结构[26]。尽管在其他MCO中也观察到了类似插入结构[25]、[27]、[28]，但在TthMCO中，β-发夹结构是Thermus属漆酶的独特结构特征[29]。相比之下，Aquifex aeolicus的McoA含有一个富含甲硫氨酸的插入结构，呈柔性环状而非β-发夹结构，这体现了MCO在调节底物可及性和反应性方面的结构多样性[28]。TthMCO的β-发夹结构包含16个残基（Ala292-Gln307），其中包括六个甲硫氨酸残基，部分阻塞了T1Cu位点的可及性，从而限制了溶剂的进入并可能影响该位点的局部环境和催化活性[29]。最近对细菌MCO的研究进一步表明，位于铜位点附近的富含甲硫氨酸的结构域不仅是空间障碍，还能主动参与调控铜离子的招募和氧化还原性质[30]。与此调节作用一致，β-发夹结构被认为可以作为pH值依赖的分子开关，在不同pH条件下调节酶的活性[29]。与T1Cu位点完全暴露于溶剂中的真菌漆酶不同[11]、[31]、[32]、[33]，TthMCO中的β-发夹结构可能解释了其对常见底物的独特催化效率[12]、[24]、[34]、[35]、[36]、[37]。分子动力学计算表明，TthMCO的β-发夹结构在两种pH值下会经历两种构象变化：在pH 5时，β-发夹结构呈“开放”构象，表面积约为295 ?2（PDB编号6Q29），从而扩大了底物的进入通道；在中性pH 7.5时，β-发夹结构呈“关闭”构象（PDB编号6TYR），表面积减少到179 ?2，相比开放构象减少了40%，这限制了底物的进入并增加了底物与T1Cu位点之间的距离，从而降低了催化效率。因此，TthMCO的β-发夹结构似乎起到pH值依赖的门控作用：在较低pH值下，T1Cu位点更易被底物接近；而在较高pH值下，其可及性降低[29]。TthMCO的β-发夹结构具有高度的构象灵活性，并通过与其他晶体结构的分子内接触得到部分稳定（PDB编号6Q29（开放构象）、2XU9（中间构象）和6TYR（关闭构象）的比较显示，接触数分别为0、4和6[29]。这种行为常见于暴露于溶剂的区域，这些区域通常电子密度较低，B值较高，晶体接触也较为不稳定。分子动力学模拟进一步证实，该结构会经历可逆的构象变化，从而调节T1Cu位点的暴露程度，促进底物的氧化[39]。鉴于β-发夹结构位于T1Cu位点入口附近，其在调节底物可及性和催化效率方面起着关键作用[40]。此外，在McoA（PDB编号6SYY）中也发现了类似的柔性插入结构，其T1Cu位点周围的开放和关闭构象被认为可以调节底物的可及性。这种构象平衡可能受到环境因素或底物结合的影响，从而微调MCO的氧化还原电位和催化性能[28]。为了研究β-发夹结构在< />MCO中的作用，我们设计了两种蛋白质突变体，每种突变体都去除了这一结构元素。第一种突变体?1去除了Gly291和Gly308之间的最灵活区域；第二种突变体?2则从Ala285到Arg311进行了较大范围的删除，暴露了更多靠近T1Cu位点的区域，从而在结构上模拟了真菌漆酶的架构。我们还分析了?2的X射线晶体结构（分辨率2.10 ?），以评估去除β-发夹结构对酶活性的影响。
突变体?1和?2的突变与克隆
为了生成这两种突变体，我们使用了含有Thermus thermophilus HB27漆酶基因（pET-TthMCO）的pET-22b载体，通过反向PCR技术[41]进行操作。对于?1突变体，需要删除残基292–307，因此设计了相应的寡核苷酸（5’-GGGCCAAGCCGGCC-3′和5’-CCCGCGGTCGTAGGG-3′）来包围这些残基，以确保扩增过程中不包含这些残基的编码序列。对于?2突变体，则删除了残基286–310。
讨论
T. thermophilus HB27漆酶的β-发夹结构位于T1铜位点（T1Cu）上方，是一个精细调节的结构元素，它控制着底物可及性、催化转化率和环境适应性的平衡。在野生型酶中，这个富含甲硫氨酸的基序（Ala292-Gln307）形成了部分空间障碍，调节底物的接近程度，而酶的催化过程依赖于外层电子转移机制
CRediT作者贡献声明
Leticia León-Luna：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，验证，方法学设计，实验研究，数据整理，概念构建。Paloma Gil-Rodríguez：方法学设计，实验研究，数据整理。Enrique Rudi?o-Pi?era：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，实验指导，资金获取，方法学设计，概念构建。
资金信息
Leticia León-Luna是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学博士项目的博士生，并获得了CONACYT奖学金（编号829684）。本研究部分资金来自墨西哥国立自治大学（UNAM）学术人员事务总局（DGAPA）通过
PAPIIT项目（编号IN226523）提供的支持。Enrique Rudi?o-Pi?era感谢
机构预算提供的财政支持。
致谢
Leticia León Luna是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学博士项目的博士生，并获得了科学、人文、技术及创新部（SECIHTI，前身为CONAHCYT）提供的奖学金（编号CVU: 579924）。我们衷心感谢Ph.D. José Alberto Hernández-Eligio和Ph.D. Angélica Vallejo-Giraldo在分子生物学研究方面的帮助，特别是在PCR优化方面的支持。
