《Archivos de Bronconeumología》：The Role of miR-320d in Regulation of Cigarette Smoke-Induced Pro-Inflammatory Responses in COPD
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本研究探讨了microRNA-320d (miR-320d)在慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 患者中调节香烟烟雾诱导的气道上皮促炎反应的作用及其异常。研究发现，在COPD患者的气道上皮细胞中，miR-320d过表达抑制促炎细胞因子（如CXCL8, IL-1α）分泌的效应受损，且其在肺组织中的表达水平随疾病严重程度而降低。这提示miR-320d的抗炎作用减弱可能是COPD中持续炎症的潜在机制，为理解疾病异质性和开发新治疗策略提供了新见解。
慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 是一种以持续性气道炎症、气道重塑和/或肺泡破坏（肺气肿）为特征的疾病，最终导致气流受限。吸入有害颗粒和气体（如香烟烟雾）是其主要风险因素。尽管吸入性糖皮质激素 (ICS) 可减轻症状，但并非所有患者对其产生应答，因此需要深入探究其潜在机制以开发新的治疗策略。气道上皮是抵御吸入性环境（包括有害颗粒）的第一道屏障，在宿主防御和维持肺稳态中起关键作用。香烟烟雾暴露会损伤气道上皮，导致多种细胞因子和趋化因子（如C-X-C基序趋化因子配体8 (CXCL8)、白细胞介素-1α (IL-1α) 和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)）的分泌。这些因子会吸引中性粒细胞、激活促炎通路（如NF-κB信号）并调节免疫细胞的存活与活化。研究表明，COPD患者痰液中这些促炎因子水平升高，但其驱动香烟烟雾诱导的异常促炎反应的分子机制尚不完全清楚。
此前研究表明，微小RNA (miRNA) 这类能调节基因表达的非编码RNA分子，可能参与COPD的发病机制。其中，miR-320d被发现具有抗炎作用，并在吸入糖皮质激素后表达上调。因此，本研究旨在探讨miR-320d是否能抑制香烟烟雾诱导的气道上皮促炎反应，以及这种抑制作用在COPD中是否受损。这一探索对于理解COPD的持续炎症机制和寻找新的治疗靶点具有重要意义。此项研究成果发表在《Archivos de Bronconeumología》期刊上。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：1) 使用原代支气管上皮细胞 (PBECs) 进行体外功能研究：细胞来源于非COPD对照和GOLD III-IV期COPD患者的移植肺组织。2) 香烟烟雾提取物 (CSE) 暴露模型：用于模拟香烟烟雾刺激。3) miRNA功能获得性实验：使用miR-320d模拟物 (mimic) 转染细胞以过表达miR-320d。4) 细胞因子检测：通过酶联免疫吸附试验 (ELISA) 测定CXCL8、IL-1α和GM-CSF的蛋白分泌水平。5) 转录组学分析：使用RNA测序 (RNA-seq) 技术分析miR-320d过表达对CSE暴露下上皮细胞基因表达谱的影响。6) 临床队列验证：在两个独立的人群队列（筛查队列和验证队列）中，利用非COPD对照组（从不/当前/既往吸烟者）和不同严重程度（轻度/中度和重度）COPD患者（当前/既往吸烟者）的肺组织样本，通过定量聚合酶链反应 (qPCR) 检测miR-320d的表达水平与疾病状态及严重程度的相关性。
研究结果
miR-320d过表达降低非COPD来源PBECs中的CXCL8和IL-1α水平，但在COPD来源PBECs中此作用受损
在非COPD来源的PBECs中，CSE暴露显著增加了CXCL8和GM-CSF（而非IL-1α）的分泌。过表达miR-320d可显著抑制基线水平及CSE刺激后CXCL8、IL-1α和GM-CSF的分泌。然而，在COPD来源的PBECs中，CSE仅显著增加了GM-CSF的分泌，而对CXCL8和IL-1α的诱导作用不显著。更重要的是，miR-320d过表达未能抑制COPD来源PBECs中CXCL8和IL-1α的分泌（无论基线还是CSE刺激后），仅对GM-CSF的抑制作用与非COPD细胞相似。这提示miR-320d对特定促炎细胞因子的抑制效应在COPD中受损。数据可视化呈现了这些差异（图1），直观展示了miR-320d在不同来源细胞中对细胞因子分泌的不同调节效果。
CSE暴露的PBECs过表达miR-320d后的转录反应
为了解miR-320d调节CSE诱导的促炎反应的机制，研究人员在非COPD来源的PBECs中进行了RNA测序。结果显示，在基线状态下，miR-320d过表达未显著改变基因表达。然而，在CSE暴露下，miR-320d过表达导致了137个基因的差异表达，其中55个基因上调，82个基因下调。基因本体论 (GO) 和通路富集分析显示，上调基因在“白细胞介素-33介导的信号通路”中富集，而下调基因则在“对细胞因子的反应”（包括IRAK1）等通路中富集。这支持了miR-320d参与抑制香烟烟雾暴露下气道上皮的促炎反应。分析结果以火山图形式展示（图2），清晰呈现了受miR-320d调控的显著上调和下调基因。
受miR-320d过表达调控的差异表达基因参与IL-1β/NF-κB信号通路
鉴于先前研究提示miR-320d可减少IL-1β诱导的NF-κB激活，本研究特别关注了该通路相关基因。RNA-seq数据显示，在CSE暴露下，miR-320d过表达显著下调了IRAK1（白细胞介素1受体相关激酶1）的表达。qPCR验证进一步确认，在非COPD来源PBECs中，miR-320d能下调IRAK1的mRNA表达（基线时显著，CSE刺激下有趋势）。然而，在COPD来源的PBECs中，miR-320d模拟物无法抑制IRAK1的mRNA表达，且其抑制效果在两组细胞间存在显著差异。这提示IRAK1可能是miR-320d发挥抗炎作用的一个关键下游靶点，且该调控在COPD中失效。
非COPD吸烟者和COPD患者肺组织中miR-320d表达水平较低
为了评估miR-320d表达是否与COPD相关，研究人员在两个独立的肺组织队列中检测了其表达水平。在筛查队列中，与从不吸烟者相比，对照组吸烟者和COPD患者的miR-320d表达水平显著降低。在验证队列中，COPD患者miR-320d表达低于从不吸烟者的结果得到确认。进一步分析疾病严重程度的影响发现，在验证队列中，重度（GOLD IV期）COPD患者的miR-320d表达水平显著低于轻度/中度（GOLD II期）患者和对照组吸烟者；在筛查队列中，严重程度间的差异不显著。此外，在筛查队列中观察到miR-320d表达与吸烟包年数呈负相关，在验证队列中则与第一秒用力呼气容积 (FEV1) 和一氧化碳弥散量 (DLCO) 呈正相关。这些结果表明，吸烟者和COPD患者的miR-320d表达降低，且其表达水平可能随COPD严重程度增加而进一步下降。结果通过箱线图进行了直观比较（图3）。
研究结论与意义
本研究证实了miR-320d在支气管上皮细胞中具有抑制基线和CSE诱导的促炎反应的抗炎作用，并首次揭示这种效应在COPD中被削弱。RNA测序表明，miR-320d过表达主要在CSE暴露下影响基因表达谱，其下调的基因与“对细胞因子的反应”通路相关，支持了其在抑制促炎反应中的作用。该通路中的关键基因IRAK1在非COPD细胞中被miR-320d下调，但在COPD细胞中这一调控失效，这与miR-320d无法抑制COPD细胞中CXCL8和IL-1α分泌的现象一致。此外，临床组织样本分析显示，吸烟者和COPD患者肺组织中miR-320d表达降低，且在验证队列中，其表达水平随COPD严重程度加重而进一步下降。
综上所述，这些数据表明，miR-320d的抗炎作用在COPD中可能因表达水平降低和/或功能效力减弱而受损。这为理解COPD中持续存在的异常气道炎症提供了新的分子机制见解。研究结果提示，miR-320d表达或功能的异常可能与COPD患者对吸入性糖皮质激素 (ICS) 反应的异质性有关，甚至可能影响其对新型生物制剂的反应。因此，miR-320d未来有潜力作为临床生物标志物。本研究强调，miR-320d表达和作用的改变可能促进了COPD中异常、持续的炎症，针对其通路进行干预或许能为开发新的治疗策略提供方向。未来的功能研究有必要进一步探讨miR-320d在COPD炎症反应异质性和治疗应答差异中的具体作用。
