基于混合模型确定hiPS细胞球冷冻工艺设计空间：实现高品质与高产量的协同优化

《Digital Chemical Engineering》：Design space determination of freezing processes for human induced pluripotent stem cell-derived spheroids using hybrid modeling

本研究针对人类诱导多能干细胞(hiPS cell)来源的球状体（spheroid）冷冻保存过程中，由于球体尺寸变异性大导致细胞存活率难以保障的产业难题，开发了一种结合机理建模与统计建模的混合模型。该模型将冷却速率与球体平均半径作为输入，成功预测了解冻后的细胞回收率，并应用设计空间概念，在综合考虑产品质量（细胞回收率）与生产效率（活细胞数）约束下，确定了冷冻工艺的可行操作区域。这项工作为hiPS细胞球的大规模工业制造提供了关键的工艺设计与质量控制理论依据，具有重要的工程应用价值。

　　

在再生医学的广阔前景中，人类诱导多能干细胞(hiPS cells)及其衍生的球状体（spheroid）扮演着关键角色。这些细胞聚集体更接近于体内的三维微环境，在疾病建模、药物筛选乃至细胞治疗方面展现出巨大潜力。然而，要将这些实验室的“明日之星”转化为可大规模应用的“现货型”产品，一个绕不开的环节便是长期保存与运输——即冷冻过程。冷冻好似给细胞按下“暂停键”，但这个过程本身却危机四伏，尤其是对于尺寸不一、结构复杂的球状体而言。传统的单细胞冷冻经验往往不再适用，球体内部的热质传递、保护剂(CPA)渗透以及冰晶形成过程都更为复杂，导致解冻后细胞存活率（cell recovery ratio）波动大、重复性差，这成为了hiPS细胞球走向工业化生产的核心障碍。如何为这些形态各异的细胞团找到一条既保“质”（高存活率）又保“量”（足够活细胞数）的冷冻路径，是研究人员亟待攻克的难题。

为了解决上述问题，来自东京大学的研究团队在《Digital Chemical Engineering》上发表了一项创新性研究。他们巧妙地将描述物理过程的机理模型与关联过程参数与最终质量的数据驱动模型相结合，构建了一个用于hiPS细胞球冷冻工艺设计的混合模型，并首次应用“设计空间”的概念，为这一复杂生物过程划定了确保质量的“安全操作区”。

为了构建这个预测模型，研究人员主要采用了以下几项关键技术方法：首先，他们基于hiPS细胞球进行了系统的冷冻实验，获取了不同冷却速率（B）和球体平均半径（R_sph^ave）下的关键实验数据，特别是解冻前后的活细胞数量，用于计算观测细胞回收率。其次，他们建立了一个包含热传递、质量传递和结晶（冰晶形成）子模块的机理模型，用以模拟冷冻过程中球体的物理变化，如因渗透压差导致的脱水（细胞体积变化）以及胞内冰形成(IIF)。最后，他们利用统计学方法（统计建模）将机理模型计算出的物理损伤指标（如归一化的球体体积变化 ΔV?_sph和归一化的胞内冰体积 V?_ice）与实验测得的细胞回收率关联起来，从而构建出完整的“过程参数-细胞质量”预测链条。

模型开发与假设：研究将hiPS细胞球在冷冻前的情境设定为：在含有冷冻保护剂(CPA，本研究使用DMSO)的溶液中浸泡3小时后，置于小瓶中心进行程序降温。模型将球体视为一个可渗透CPA的大型“单细胞”，并考虑了细胞膜水渗透性(L_p)等关键参数。

热传递模型：该部分描述了冷冻过程中小瓶内的径向和瞬态温度分布，并追踪了固-液界面（冰锋面）的移动位置（δ），这是后续计算冰晶生长的基础。

质量传递模型：这是本研究针对球体特性的重要扩展。模型不仅描述了CPA在球体内的扩散过程（表观扩散系数 D_app），还基于经典的“两因素假设”模型，计算了因外部溶液结冰产生渗透压差所导致的细胞脱水及球体总体积变化。这部分通过加和球体内所有单细胞的水分跨膜运输来估算整个球体的体积变化。

结晶模型：该部分模拟了胞内冰的形成过程，包括均相成核(HOM)、表面催化成核(SCN)和体积催化成核(VCN)等多种机制，并计算了冰晶随时间的生长半径及其总体积。

参数估计与模型验证：混合模型中的关键参数（如 D_app和 关联损伤与回收率的统计模型系数）通过hiPS细胞球的冷冻实验数据进行估计。模型扩展后，能够以冷却速率（B）和球体平均半径（R_sph^ave）为输入，直接计算预测的细胞回收率（r_recov^cal）和球体内活细胞数量（N_LC）。

设计空间确定案例：在一个应用案例中，研究设定了关于质量和生产率的约束条件（例如，细胞回收率需高于某阈值，活细胞数需高于某阈值）。利用已开发的混合模型，在给定的球体半径分布（最小、最大及平均半径）下，扫描不同的冷却速率，最终在“冷却速率-球体平均半径”的二维平面上，确定了一个能满足所有约束条件的区域，即该冷冻工艺的“设计空间”。只要操作点落在此区域内，即可保证即使球体尺寸存在波动，其冷冻结果也能满足预定的质量和产量要求。

本研究成功开发并验证了一个用于hiPS细胞球冷冻过程的混合模型，该模型有机整合了描述物理现象的机理模型和关联损伤与存活率的数据驱动模型。模型的核心价值在于，它能够将可调控的工艺参数（冷却速率）和固有的物料属性（球体尺寸）与最终的产品质量指标（细胞回收率）和生产率指标（活细胞数）定量地联系起来。

这项研究的结论和意义十分深远：首先，它提供了一种基于模型的、理性的工艺开发方法，能够显著减少传统上依赖大量试错的实验成本和时间。其次，通过引入“设计空间”这一源于制药行业的先进理念，研究为hiPS细胞球这类变异性大的生物制品的冷冻工艺提供了强大的质量控制工具。操作人员可以直观地依据设计空间来制定工艺，确保即使在球体尺寸存在自然波动的情况下，生产过程也能持续产出符合质量要求的产品。这跨越了从实验室“能够冻存”到工业化“稳定、可靠、经济地冻存”的关键一步，为hiPS细胞及其衍生产品的大规模制造、库存管理和全球化供应链奠定了基础，有力推动了再生医学的产业化进程。