《ACS Applied Nano Materials》：Cytosolic Delivery of a Bithiophene Derivative via Polymersomes Kills Trypanosoma cruzi Amastigotes and Modulates the Inflammatory Response
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本文报道了一种装载联噻吩衍生物BTAc的聚乙二醇-聚丙基硫醚（PEG-b-PPS）聚合物囊泡（PS）纳米递送系统。该系统能将药物高效递送至巨噬细胞细胞质，显著增强对克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）细胞内无鞭毛体的杀伤效果（IC50值低至6.17 μg/mL），同时将促炎细胞因子水平降至基线，展现出优异的双重抗寄生虫与免疫调节潜力，为慢性恰加斯病（CD）的治疗提供了创新策略。
摘要
恰加斯病（Chagas disease， CD）是一种由胞内寄生原虫克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起的被忽视的热带病，其慢性阶段可导致严重的心肌炎。目前的一线药物苯硝唑（benznidazole， BZN）和硝呋莫司（nifurtimox）在慢性期疗效有限且毒副作用显著。本研究开发了一种基于氧化敏感型两亲性嵌段共聚物聚乙二醇-聚丙基硫醚（PEG-b-PPS）的聚合物囊泡（polymersomes， PS）纳米递送系统，用于递送新型联噻吩衍生物4-(5′-甲酰基-[2,2′-联噻吩]-5-基)丁-3-炔-1-基乙酸酯（BTAc），旨在同时提升抗寄生虫疗效并调节感染引发的炎症反应。
引言
近年来，纳米颗粒已成为增强药物递送的有效策略。其中，聚合物囊泡等合成纳米载体（SNC）在结构稳定性和可控释放方面优于脂质体。PEG-b-PPS因其能够形成双层囊泡结构并靶向巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞而备受关注。BTAc是本课题组新报道的具有抗锥虫活性的合成联噻吩化合物，但其对克氏锥虫无鞭毛体（慢性感染期的主要细胞内繁殖形式）的活性中等且水溶性有限。基于此，本研究假设PEG-b-PPS聚合物囊泡能够改善BTAc的递送效率并调节感染诱导的炎症。
材料与方法
分子与纳米载体制备：通过薄层水化法制备了负载BTAc的聚合物囊泡（BTAc-PS）和空白囊泡（B-PS）。优化后采用药物:共聚物质量比2:20进行制备。利用动态光散射（DLS）、小角X射线散射（SAXS）、冷冻透射电镜（Cryo-TEM）和纳米颗粒跟踪分析（NTA）对纳米载体进行理化表征。
生物活性评价：在RAW 264.7巨噬细胞感染模型中，评估了BTAc-PS、B-PS、游离BTAc和BZN对三种克氏锥虫菌株（CL Brener、Brazil和Y）细胞内无鞭毛体的抗寄生虫活性，并计算了半数抑制浓度（IC50）和选择性指数（SI）。同时，通过MTT法评估了对哺乳动物细胞的细胞毒性。
细胞内递送追踪：采用荧光共振能量转移（FRET）技术，以DiI（供体）和DiD（受体）作为染料对制备FRET-PS，通过共聚焦显微镜实时监测纳米载体在感染巨噬细胞内的摄取和内容物释放过程。
超微结构与生化分析：通过透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）观察处理后的巨噬细胞和寄生虫的超微结构变化。使用流式细胞术微球阵列（CBA）试剂盒检测细胞因子（如TNF-α、IFN-γ、IL-6）水平，并使用荧光探针检测活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）水平。
结果
纳米载体的制备与表征：优化后的BTAc-PS平均粒径约为120 nm，多分散指数（PDI）低，呈现均一的囊泡结构，包封率约为33.8%。SAXS和Cryo-TEM结果证实了其囊泡形态。在含10%胎牛血清（FBS）的PBS中，药物在48小时后开始快速释放，而在无蛋白的PBS中更稳定。纳米载体在4°C、25°C和37°C下储存60天，粒径保持稳定。
抗锥虫活性与选择性：BTAc-PS对三种克氏锥虫菌株的无鞭毛体均表现出增强的杀灭效果，IC50值分别为6.17（CL Brener）、24.01（Brazil）和30.68（Y）μg/mL，均显著低于游离BTAc。空白B-PS无抗寄生虫活性。BTAc-PS对CL Brener菌株表现出最高的选择性指数（SI = 26.99）。对巨噬细胞有一定细胞毒性，但无溶血活性。
细胞内递送机制：FRET共聚焦成像分析显示，纳米载体在2小时内被巨噬细胞内吞，4小时后囊泡内信号增加。至关重要的是，在24小时后，FRET信号在细胞质中呈弥散分布，表明完整的聚合物囊泡成功逃离内吞体区室，进入细胞质并释放其负载物。未观察到纳米载体与细胞内无鞭毛体的共定位。
超微结构变化：电镜观察发现，经BTAc-PS或游离BTAc处理的感染巨噬细胞内，寄生虫数量显著减少。残留的无鞭毛体出现染色质结构紊乱，BTAc-PS处理组还观察到线粒体肿胀。游离BTAc处理可导致巨噬细胞出现双核现象和染色质凝聚。
免疫调节作用：感染导致巨噬细胞促炎细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6以及ROS水平显著升高。BTAc-PS和游离BTAc处理均能将IL-6和ROS水平恢复至基线。特别是游离BTAc，能显著降低感染和非感染巨噬细胞的TNF-α和IFN-γ水平。BTAc-PS处理还进一步提高了细胞内NO水平。而BZN和B-PS则未能表现出类似的免疫调节能力。
讨论
本研究成功开发了负载BTAc的PEG-b-PPS聚合物囊泡系统。该纳米载体尺寸均一，适合被巨噬细胞高效摄取。FRET分析首次直观证实了该纳米载体在内吞后能保持结构完整性地逃逸至细胞质，从而实现细胞质内靶向递送，这对于攻击存在于细胞质中的克氏锥虫无鞭毛体至关重要。
BTAc-PS对克氏锥虫不同菌株均显示出增强的抗寄生虫活性，其效果与菌株对BZN的敏感性趋势相关。更重要的是，BTAc分子本身及纳米制剂展现了强大的免疫调节功能，能有效将感染引发的过度促炎反应（如升高的IL-6、ROS）调节回正常水平。这种兼具杀虫和抗炎的双重作用，恰好应对了慢性恰加斯病治疗中需要同时清除寄生虫和控制免疫病理损伤的挑战。
与现行标准药物BZN相比，BZN虽在某些菌株上选择性指数更高，但缺乏免疫调节特性，且在慢性期疗效不佳、毒性大。本研究提出的纳米递送策略，为开发既能有效杀伤寄生虫又能调节有害炎症的新型恰加斯病疗法提供了有前景的平台。
结论
综上所述，负载联噻吩衍生物BTAc的聚合物囊泡纳米递送系统，通过实现高效的细胞内药物递送，显著增强了对克氏锥虫无鞭毛体的杀伤作用，并同时展现出调节宿主过度炎症反应的潜力。这项研究为开发针对慢性恰加斯病的、兼具抗寄生虫和免疫调节功能的新型联合治疗策略奠定了坚实的基础。未来需要在动物模型中进行更深入的体内药效与安全性评价。
