《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Hair Follicle Organoids Using Human iPSC-Derived Ectodermal Precursor Cells for Hair Regenerative Medicine
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本综述系统阐述了基于人诱导多能干细胞（hiPSC）构建毛囊类器官（HFO）用于毛发再生医学的最新进展。研究展示了采用临床适用的I型胶原蛋白替代Matrigel基质，成功诱导出具有高效毛囊再生能力的小鼠胶原基毛囊类器官（cHFO）。更进一步，研究团队将hiPSC定向分化为外胚层前体细胞（hiPSC-EPC），并与小鼠间充质细胞共培养，成功构建出人/鼠嵌合HFO，该嵌合体在体外和体内均展现出毛囊再生能力，为未来开发完全人源化的、可临床移植的毛发再生治疗方案提供了关键的技术路径和概念验证。
研究背景与引言
毛发再生医学旨在通过移植包含上皮和/或间充质细胞群的组织移植物来再生新生毛囊，从而治疗如雄激素性脱发等毛发缺失问题。其中，毛囊胚（HFG）样聚集体因其模拟胚胎发育过程中毛囊诱导的关键步骤而备受关注。然而，成人毛囊来源的干细胞再生能力有限，而使用人胎儿皮肤细胞又面临伦理挑战，因此，寻求可扩展且功能强大的人类细胞来源成为关键。
类器官培养作为再生医学中组织移植物的潜在来源，已成功利用小鼠和人诱导多能干细胞（hiPSC）在体外再生出包含毛囊的皮肤类器官。但这类诱导过程通常耗时长达4-5个月。本研究团队此前利用小鼠胚胎皮肤来源的上皮和间充质层细胞，通过补充极低浓度的Matrigel，成功构建了体外毛囊萌发效率接近100%的小鼠毛囊类器官（HFO）。然而，Matrigel来源于小鼠肉瘤，不适合临床应用，亟需寻找临床适用的细胞外基质（ECM）替代品。I型胶原蛋白是体内最丰富的ECM，已用于包括再生医学在内的人类治疗，是本研究的重点替代候选。
实验材料与方法
本研究使用了C57BL/6J裸鼠、BALB/c裸鼠和SCID无毛远交系小鼠等动物模型，所有实验均遵循动物伦理规范。小鼠胚胎上皮和间充质层细胞通过酶消化和机械分离获得。人iPSC系（201B7）在Easy iMatrix511包被的板上进行无饲养层扩增培养，并通过形成拟胚体后添加全反式维甲酸和BMP4，定向分化为细胞角蛋白18（KRT18）阳性的外胚层前体细胞（hiPSC-EPC），分化效率通过流式细胞术和免疫荧光验证。
胶原基小鼠毛囊类器官（cHFOs）的制备
研究首先探讨了I型胶原蛋白浓度对小鼠HFO毛囊萌发的影响。结果显示，在24至240 μg/mL浓度范围内，毛囊萌发数量显著增加，其中以24 μg/mL和120 μg/mL效果为佳。浓度过低（2.4 μg/mL）时，细胞仅形成类似HFG的哑铃状结构而无毛囊萌发；浓度过高（>240 μg/mL）则会因基质密度和硬度增加而抑制细胞迁移和毛囊形成。通过对cHFO的形态学分析证实，体外生成的毛囊具有典型的毛囊结构，包括毛球、毛干、真皮乳头、脂肪和毛囊隆起，并含有Versican/Sox2阳性的真皮乳头细胞、CD34/KRT15阳性的毛囊干细胞、c-KIT/gp100阳性的黑色素细胞以及油红O阳性的脂肪细胞，与天然毛囊高度相似。
小鼠cHFOs的移植
通过斑块实验评估了小鼠cHFOs在裸鼠皮肤上的毛发再生能力。移植培养6天的cHFOs（使用24或120 μg/mL胶原）和Matrigel基HFOs（mHFOs）均显示出比不添加ECM的HFGs对照组显著更高的毛发再生效率，且cHFOs与mHFOs之间的再生能力无显著差异，证明I型胶原蛋白能够提供与Matrigel等效的、适于HFO形成的微环境。计算表明，cHFO移植的毛发再生效率（4根毛发/104个细胞）远高于传统的直接细胞悬液移植方法（1.3根毛发/104个细胞），这可能是由于细胞聚集体在移植部位的存留更有效。此外，研究讨论了改善移植微环境（如促进血管吻合、抑制巨噬细胞浸润）对进一步提升再生效率的可能性。
hiPSCs向hiPSC-EPCs的分化
为解决人类细胞来源的瓶颈，研究将hiPSCs分化为hiPSC-EPCs。分化过程中，多能性标记基因OCT4和SOX2的表达下降，而上皮前体细胞标记基因KRT18的表达上调。培养第11天，83.5%的细胞KRT18呈阳性。将分化得到的hiPSC-EPCs与小鼠胚胎间充质细胞在Matrigel培养基中共培养，可形成人/鼠嵌合HFO，并在培养第7天左右观察到毛囊萌发，但其萌发效率（13.6%）和速度均低于纯小鼠HFO。基因表达分析显示，人源KRT33a（毛皮质角蛋白标记）基因在人/鼠嵌合HFO培养过程中表达上调，免疫染色也证实了KRT33a和KRT15阳性细胞存在于萌发的毛囊结构中，表明hiPSC-EPCs具有再生毛囊的潜力。荧光标记实验进一步显示，hiPSC-EPCs部分参与了再生毛囊的形成。
基于hiPSC-EPCs的人/鼠嵌合cHFOs的移植
将hiPSC-EPCs与小鼠间充质细胞在I型胶原蛋白培养基中培养，形成的人/鼠嵌合cHFOs在体外表现出毛囊萌发。进一步的体内斑块实验证明，这些嵌合cHFOs移植后能够生成黑色毛干，而使用传代后的人胎儿皮肤上皮细胞构建的嵌合cHFOs或仅由小鼠间充质细胞组成的聚集体则无法再生毛发。这突显了hiPSC-EPCs作为上皮细胞来源的独特优势：它们能在分化前大量扩增，避免了传代导致的功能丧失，为HFO制备提供了更可靠、可扩展的细胞来源。然而，研究也指出使用人iPSC仍存在表观遗传记忆、高成本、分化耗时等潜在限制。
结论与展望
本研究成功利用低浓度I型胶原蛋白诱导出小鼠cHFOs，并证明其毛发再生效率与Matrigel体系相当。更重要的是，研究首次实现了将hiPSC-EPCs作为人类上皮细胞来源，用于构建具有体外和体内毛囊再生能力的人/鼠嵌合HFOs。这项工作不仅建立了一种无Matrigel的HFO培养体系，还为使用hiPSC来源的细胞替代传统人类细胞进行毛发再生提供了概念验证。未来的研究方向包括进一步优化培养条件，以及使用hiPSC来源的间充质细胞构建完全人源化的HFOs，并对其安全性和临床适用性进行全面评估，从而推动毛发再生医学向临床转化迈进。
