《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Enhancing Biocompatibility and Biophysical Properties of Three-Dimensional Collagen Scaffolds Using Nonthermal Plasma Treatment
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本文评述了利用非热等离子体（NTP）这一新兴技术对胶原-糖胺聚糖（CG）三维支架进行表面改性的研究。研究表明，NTP处理能在不改变材料化学本体的前提下，显著提升支架的力学性能、孔隙率与亲水性，并有效促进脂肪干细胞（ADSC）的附着、增殖及向成骨谱系的定向分化，展现出其在骨再生等组织工程领域替代传统化学交联的潜力。
引言
胶原（Collagen）支架因其优异的生物相容性、生物传导性和低免疫原性，在组织工程（特别是高级伤口敷料）领域已作为一种重要的生物相容性生物材料崭露头角。当其与硫酸软骨素或透明质酸等糖胺聚糖（GAGs）组合形成复合物时，它们能通过扮演大分子配体或蛋白质介质的角色，调节组织稳态、细胞迁移和细胞信号传导，从而刺激伤口愈合。然而，这类支架固有的低机械稳定性和易受酶降解的弱点，限制了其临床应用。传统的化学交联剂，如碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺联用，虽能有效提升支架的机械强度和抗酶解能力，但存在潜在的细胞毒性风险，且可能改变支架的生物特性，并需要多次洗涤步骤以避免残留物导致细胞死亡。
无需溶剂的新型技术，如非热等离子体（Nonthermal Plasma， NTP）处理，已成为一种替代方案。NTP通过电离气体放电产生，在相对较低的气体温度和压力下加速带电粒子，从而形成稳定可控的等离子体。由于其非热特性，NTP处理不会显著改变生物材料的化学组成或基本性质，能够在保持材料固有化学结构的同时，实现对表面特性和生物物理特性的精准改性。此外，NTP处理的优势还包括：单步、快速、无溶剂、环境友好，且不会引入潜在细胞毒性残留物。
尽管如此，关于NTP处理对胶原基支架影响的研究尚少。本研究旨在探究射频定制氮气等离子体处理对胶原-糖胺聚糖（Collagen-glycosaminoglycan， CG）支架的生物物理效应，及其对脂肪来源干细胞（ADSCs）附着、生长和分化等生物相容性的影响。
材料与方法
CG支架制备：采用优化的冷冻干燥技术制备CG支架，将牛肌腱I型胶原与硫酸软骨素-6-硫酸钠在乙酸中混合、脱气后冷冻干燥，得到高孔隙率、均质的支架片，并使用无菌活检针冲出8毫米和5毫米直径的支架。
非热等离子体处理：使用等离子体清洗机，在特定参数（射频13.56 MHz，功率30 W，压力100 mTorr，氮气流速49 mL/min）下，对支架分别进行2分钟和5分钟的暴露处理。
表征与分析：通过扫描电子显微镜（SEM）和组织学（阿利新蓝染色）评估支架表面形态和孔隙结构。利用能量色散X射线光谱（EDS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析元素组成和化学官能团变化。通过压缩测试评估干态支架的压缩模量。使用接触角测量评估亲水性变化，并通过视频记录分析液体吸收速率。在含胶原酶的缓冲液中孵育，评估支架的酶解速率。
细胞实验：将人类脂肪来源干细胞（ADSCs）接种于未经处理及NTP处理的支架上。使用Alamar Blue法检测细胞活力，通过DAPI染色进行细胞计数。将细胞-支架复合物置于成骨诱导培养基中培养21天，通过阿尔新红染色评估钙沉积，并使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测成骨相关基因RUNX2和骨钙素（Osteocalcin， OCN）的表达水平。
结果
1. 表面形态、孔径与组织学特性评估
SEM分析显示，与未处理对照组相比，经过2分钟和5分钟NTP处理的CG支架表面形态发生了改变。孔隙增大，孔隙支柱随着等离子体暴露时间的增加而增粗。组织学阿利新蓝染色也证实了这一点，经NTP处理的支架孔隙支柱染色更深，可能是胶原纤维增厚的表现。孔径分析表明，5分钟NTP处理组的孔隙面积、周长和费雷特直径均显著大于对照组和2分钟处理组。所有组别的孔隙纵横比均大于1，表明孔隙呈拉长状。
2. NTP处理支架表现出增强的压缩模量
干态压缩测试显示，未经处理对照组的压缩模量为6354.2 ± 1131.1 Pa，2分钟和5分钟NTP处理组分别提升至7401.3 ± 1325.2 Pa和7279.0 ± 1948.5 Pa。这表明NTP处理后，支架的机械强度在2分钟和5分钟处理组均得到显著增强。
3. NTP处理后支架的化学组成和元素谱未发生改变
FT-IR光谱分析显示，在酰胺I带（~1630 cm-1）、酰胺III带（~1230 cm-1）以及碳水化合物基团（~1080 cm-1）等特征吸收区间，NTP处理组与对照组的光谱高度一致。对于硫酸软骨素特有的硫酸根基团（~1350 cm-1和1242 cm-1）也未观察到变化。这证明等离子体处理后，支架的主要化学官能团保持完整，化学组成高度保守。
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EDS元素分析同样表明，碳、氮、氧和硫等元素的水平在NTP处理后未发生显著改变。
4. NTP处理后亲水性与吸收速率增强
接触角测量结果显示，未经处理支架的接触角为106.7°，表现出更强的疏水性。相比之下，2分钟和5分钟NTP处理后的支架接触角分别降至85.9°和91.2°，亲水性显著增强。液体吸收速率测试显示，未处理支架完全吸收液体约需13秒（吸收速率0.2 μL s-1），而两个NTP处理组的吸收速率则高达30 μL s-1，所需时间仅为未处理组的十分之一。
5. NTP处理支架的酶解速率
酶解实验表明，5分钟NTP处理组的降解速率在所有时间点均显著高于对照组。而2分钟处理组的降解模式则与对照组相似。
6. NTP处理支架上细胞附着与代谢活性增强
DAPI染色显示，在接种后第5天，与未处理对照组相比，2分钟和5分钟NTP处理组支架上的细胞数量均有统计学意义上的显著增加。细胞活力测试显示，在接种后第3天，2分钟NTP处理组的细胞活力显著高于对照组。5分钟处理组的细胞活力虽也有增加，但未达到显著水平。
7. NTP处理支架支持向促成骨谱系分化
在成骨诱导培养21天后，阿尔新红染色显示，NTP处理的胶原支架比未处理对照组沉积了更多的钙。这证实了ADSCs在NTP处理支架上向成骨细胞分化程度更高。
qRT-PCR分析表明，与对照组相比，NTP处理组支架上成骨标志基因RUNX2的表达量提高了约9倍，而晚期成骨标志物骨钙素（OCN）的表达量也提高了约2.5至2.3倍。
讨论
支架的生物相容性与生物物理性能对细胞与生物材料的相互作用至关重要。胶原支架虽具有优异的生物相容性，但在临床应用中通常需要额外的交联处理以改善其生物物理特性。本研究评估了使用NTP作为替代交联技术对胶原支架的影响。
SEM和组织学分析表明，等离子体处理改变了支架的孔隙结构和壁厚，从而增加了其机械刚度。5分钟处理组孔隙和支柱增厚最为明显，这可能有利于细胞和血管的长入。其机制可能是高能离子化等离子体粒子对表面的轰击，导致胶原纤维发生微小的重排，从而使纤维聚集更紧密，同时增大了纤维间的孔隙。
机械测试显示，氮气NTP处理使胶原支架的压缩模量增加了约16-17%。这归因于等离子体诱导的表面交联或致密化效应。重要的是，FT-IR和EDS分析证实，支架的主要化学官能团和元素组成在等离子体处理后保持不变，这表明NTP在改变支架孔隙形态的同时，并未损害其生物化学本质。
接触角分析证实NTP处理显著提高了支架的亲水性。亲水性的增加有利于蛋白质吸附和细胞粘附。酶解实验表明，短暂（2分钟）的NTP处理对支架的耐久性影响最小，而更长时间（5分钟）的处理则会因微结构改变而增加酶的易接近性。
细胞实验结果显示，2分钟NTP处理的CG支架在第3天和第5天显示出增强的ADSCs附着和活力。这可能得益于其优化的孔隙结构、增强的亲水性以及完好的生化完整性三者产生的协同效应。5分钟处理组活力的轻微降低，可能反映了表面的过度改性。
在骨再生方面，NTP处理的支架表现出更强的促成骨潜力。阿尔新红染色和基因表达分析均证实，ADSCs在NTP处理支架上具有更高的成骨分化效率。RUNX2和骨钙素（OCN）的显著上调，表明这些支架不仅支持细胞存活，还能主动促进成骨谱系定向。
结论
综上所述，本研究证明，NTP处理能有效增强胶原支架的生物物理和生物相容性能，同时保持其化学完整性。通过提高支架的刚度、孔隙率和亲水性，NTP处理促进了更优的细胞增殖和成骨分化，这是成功实现组织再生的关键因素。从临床转化角度来看，这些进展表明，NTP改性胶原支架可作为一种更安全、更有效的传统交联方法替代品，有望改善骨及其他结缔组织再生治疗的预后。NTP技术的非侵入性和多功能性，进一步支持了其在开发用于个性化组织工程和再生医学应用的先进生物材料中的转化潜力。
