《ACS Chemical Health & Safety》：DNA Methylation Alterations in Benzene-Exposed Gasoline Station Workers: Insights from Singleplex MethyLight Analysis
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这篇综述系统性分析了苯暴露对加油站工人DNA甲基化模式的影响，重点探讨了TGFβ2、MAGE-A1及LINE-1等位点的甲基化改变与血液毒性、致癌风险的关联。研究发现苯暴露可引发全局性低甲基化（如LINE-1）与基因特异性甲基化失调（如MAGE-A1、TGFβ2），并伴有白细胞、红细胞、血小板等血液指标显著异常（p< 0.0001）。这些甲基化改变可能是苯致血液毒性与白血病风险的重要表观遗传机制，为职业健康风险评估提供了潜在的早期分子生物标志物。
1. 引言
加油站工人长期暴露于多种职业危害中，包括脂肪族和芳香族化合物。其中，苯、甲苯、乙苯和二甲苯等石油衍生的化学物质毒性强且具有致癌性，苯尤其因其高挥发性成为主要的环境污染物之一。苯缺乏安全的暴露阈值，被公认为强效的职业性血液毒素和致白血病物质。长期慢性苯暴露与一系列急慢性健康影响相关，包括血液毒性、骨髓抑制、贫血、免疫抑制，并增加感染易感性；对女性而言，高水平暴露还与月经不调和卵巢萎缩有关。苯暴露的遗传毒性后果包括染色体畸变、姐妹染色单体交换和DNA突变，可能表现为白细胞减少、血小板减少、再生障碍性贫血和白血病等血液疾病。
近年来，表观遗传改变被认为是苯诱导毒性的关键机制。即使低剂量暴露，苯也可以通过改变DNA甲基化模式和miRNA谱来扰乱基因表达。异常的DNA甲基化是许多癌症的标志，其中启动子区CpG岛的高甲基化导致基因沉默，而LINE-1等重复序列的整体低甲基化则可能导致基因组不稳定。LINE-1的低甲基化尤其重要，因为其甲基化水平降低可能重新激活逆转录转座子，诱发染色体重排并加剧基因组不稳定性。
先前研究报道，在苯暴露工人中观察到LINE-1和MAGE-A1的低甲基化以及抑癌基因如p15的高甲基化。在中国职业队列中，苯暴露与LINE-1的低甲基化以及MGMT和hMLH1的高甲基化有关。本研究的目的是利用单重Methylight聚合酶链式反应技术，评估职业性苯暴露对沙特阿拉伯加油站工人TGFβ2、MAGE-A1和LINE-1DNA甲基化状态的影响。
2. 材料与方法
2.1. 研究人群与血液样本收集
本研究招募了两组成年男性，暴露组为30名每天职业性接触汽油的加油站工人，对照组为30名无汽油暴露史的男性。受试者均无血液、肝脏、肾脏或慢性炎症性疾病诊断史，且排除了有石化职业暴露史、近期接受化疗或放疗、长期饮酒、患有急性疾病或服用已知影响DNA甲基化药物的人群。记录所有参与者的吸烟史，并在统计分析时将其作为潜在混杂因素。
一项先验效能分析显示，每组样本量为30的研究设计具有约80%的统计效能来检测效应量约为0.72的中等到大效应。
2.2. 血液学和生化分析
使用全自动血液分析仪测量血红蛋白、红细胞计数和白细胞计数等指标。使用生化自动分析仪测定丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶和肌酐水平。
2.3. DNA提取与亚硫酸氢盐转化
使用试剂盒从全血中提取基因组DNA，并通过亚硫酸氢盐转换试剂盒进行处理，以实现甲基化特异性分析。
2.4. Methylight聚合酶链式反应检测
使用单重Methylight聚合酶链式反应分析MAGE-A1、TGFβ2和LINE-1的甲基化状态。引物和探针经过专门设计，探针使用黑洞淬灭剂标记。每个反应体系包含特定浓度的引物、探针、Master Mix和经亚硫酸氢盐转化的DNA。聚合酶链式反应循环条件为：95°C 5分钟预变性，随后进行50个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。
2.5. 质量控制与统计分析
所有检测均进行了分析验证。使用完全甲基化的对照DNA生成标准曲线以确保效率、线性度和灵敏度。检测下限定义为产生可重复扩增的最低DNA输入量，对应于每反应1至5纳克亚硫酸氢盐转化DNA。所有样本均进行技术重复分析，计算平均循环阈值并用于后续分析。
使用序列检测软件分析数据。通过标准曲线和公式计算相对于ALU的百分比甲基化参考值。数据分析前，评估了百分比甲基化参考值的正态性和方差齐性。满足正态分布和方差齐性假设后，使用独立样本学生t检验分析两组间百分比甲基化参考值的差异。以p值小于0.05视为具有统计学显著性。
3. 结果
3.1. 人口学与暴露特征
参与者的年龄和吸烟状况在两组间无显著差异。然而，加油站工人的工作时长显著更长，直接苯暴露的比例也显著高于对照组。
3.2. 血液学与生化指标
血液学和生化分析揭示了显著的组间差异。与对照组相比，加油站工人的红细胞计数、血红蛋白浓度和平均红细胞血红蛋白均显著降低。此外，暴露组的血小板计数显著升高。在生化指标方面，暴露组的天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶水平显著高于对照组，且超出了正常参考范围。肌酐水平在两组间也存在显著差异。
3.3. DNA甲基化分析结果
甲基化分析显示，与对照组相比，苯暴露组的LINE-1和TGFβ2表现为低甲基化，而MAGE-A1表现为高甲基化。统计结果显示，LINE-1、TGFβ2和MAGE-A1的百分比甲基化参考值在两组间均存在显著差异。ALU-1的甲基化水平虽在暴露组略有降低，但差异无统计学显著性。
4. 讨论
本研究评估了慢性职业性苯暴露对沙特阿拉伯加油站工人整体和基因特异性DNA甲基化模式的影响。工人组显著更长的工作时间和更高的直接苯暴露水平，证实了其暴露状况。观察到的血液学差异，特别是暴露工人红细胞计数的显著降低，提示存在苯相关的血液毒性。血小板计数的升高则与汽油暴露可能刺激巨核细胞生成的证据相符。暴露组天冬氨酸转氨酶和丙氨酸转氨酶的升高，也表明了可能与苯及其他外源物相关的肝细胞应激。
需要指出的是，汽油是一种复杂的化学混合物，含有甲苯、二甲苯等芳香烃以及痕量金属。这些共暴露物可能通过氧化应激、炎症信号传导和干扰一碳代谢等共同生物学机制影响甲基化。虽然本研究主要关注苯，但这些共暴露物的贡献无法完全排除，可能部分解释了观察到的甲基化模式。
从表观遗传学角度看，DNA甲基化稳态的破坏是致癌过程的早期标志。像苯这样的环境致癌物可以诱导启动子区高甲基化和全局低甲基化，这种模式在恶性肿瘤中常见。本研究中LINE-1的显著低甲基化具有功能意义，因为它可能促进逆转录转座子活性和基因组不稳定性。这与其它苯暴露队列中的报道一致，表明全局甲基化丢失是苯暴露的一个一致性标志物。
基因特异性分析显示，暴露工人的MAGE-A1和TGFβ2发生了显著的低甲基化。MAGE-A1的低甲基化预期会解除对该基因表达的抑制，其启动子在体细胞组织中通常是沉默的；重新激活可能影响细胞周期调控、抑制细胞凋亡并调节免疫反应，如果发生额外的“打击”，则可能促进致癌过程。TGFβ2的低甲基化可能同样会增强其表达，影响造血和免疫调节通路。
苯诱导甲基化改变的机制基础尚未完全阐明，可能的假设包括一氧化氮介导的DNA甲基转移酶刺激、氧化DNA损伤导致甲基化CpG结合蛋白相互作用受损，以及苯诱导DNA链断裂继发的位点特异性甲基化改变。考虑到苯已被证实的遗传毒性和血液毒性，表观遗传失调可能是其多步骤致白血病模型中几个汇聚的“打击”之一。
5. 结论
本研究的结果提供了有力证据，表明长期苯暴露能够显著影响DNA甲基化模式。使用单重Methylight分析，在苯暴露个体与对照组之间观察到了MAGE-A1、LINE-1和TGFβ2甲基化水平的显著差异，这些发现与现有文献相符。这些观察强调了在高风险职业人员中遵守国际安全标准的极端重要性，建议实施定期的健康监测，包括定期评估全基因组甲基化状态，以早期发现分子改变并减轻苯及其代谢物相关的潜在健康风险。
