利用细胞穿膜肽PG-表面活性剂DKDKC12-K5胞质递送Smad2/3结合肽以阻断其核转位，高效抑制TGF-β信号通路

《Bioconjugate Chemistry》：Efficient Inhibition of TGF-β Signaling via Cytosolic Delivery of a Smad2/3-Binding Peptide Using the Cell-Penetrating PG-Surfactant DKDKC12-K5 to Block Smad2/3 Nuclear Translocation

本研究开发了一种基于细胞穿膜PG-表面活性剂（cpPG，即DKDKC12-K5）的胞质递送策略，通过将Smad2/3结合肽（SARA肽）与cpPG共价连接形成SARA-cpPG复合物，实现了高效、特异的细胞内递送。该复合物能有效抑制TGF-β1诱导的细胞迁移、肌动蛋白聚合及靶基因表达，其机制并非阻断Smad2/3磷酸化，而是通过结合并滞留Smad2/3于胞质，从而阻断其核转位。这一工作为靶向核转位信号分子的肽类疗法提供了新思路。

设计Smad2/3结合肽与胞质递送载体cpPG的共轭物

转化生长因子-β（TGF-β）信号通路在细胞增殖、分化、免疫应答及组织再生等过程中起关键调控作用。该通路由Smad2/3介导：TGF-β配体与细胞膜上的受体（TβRI/TβRII）结合后，激活的TβRI磷酸化Smad2/3，后者与Smad4形成异源三聚体并转位至细胞核，调控特定靶基因转录。为干预这一过程，研究选取了来源于Smad锚定蛋白（SARA）的Smad2结合域衍生肽段（SARA肽）作为干预分子。通过将SARA肽与先前开发的细胞穿膜PG-表面活性剂（cpPG）之一——DKDKC₁₂-K₅的马来酰亚胺衍生物（Mal-DKDKC₁₂-K₅）通过迈克尔加成反应共价连接，合成了共轭物SARA-cpPG。作为对照，还合成了结合能力缺失的突变体肽（SARAm）的共轭物SARAm-cpPG，以及使用经典穿膜肽R8构建的共轭物SARA-R8。

SARA-cpPG及其对照化合物在A549细胞中的胞质摄取行为

在A549（人肺泡基底上皮腺癌细胞）模型中，通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和流式细胞术（FACS）评估了化合物的摄取情况。荧光标记的Coc-SARA-cpPG和Coc-Mal-DKDKC₁₂-K₅均能有效进入细胞，并主要定位于胞质而非细胞核。与单独的载体DKDKC₁₂-K₅相比，SARA-cpPG的摄取速度较慢但最终累积量相当，且显著高于SARA-R8的摄取量。内吞途径抑制剂实验表明，DKDKC₁₂-K₅主要通过小窝蛋白依赖的内吞途径进入细胞，而SARA-cpPG和SARA-R8则主要通过巨胞饮途径被内化。

从伤口愈合实验和肌动蛋白丝聚合评估SARA-cpPG对TGF-β信号通路的抑制效果

宏观细胞功能实验显示，TGF-β1刺激可诱导A549细胞发生上皮-间质转化（EMT），表现为细胞迁移能力增强和肌动蛋白纤维聚合增加。在伤口愈合实验中，添加SARA-cpPG（10 μM）能显著抑制TGF-β1诱导的细胞迁移，其抑制效果与TGF-β I型受体激酶抑制剂LY2157299相当，而SARAm-cpPG或SARA-R8则无明显抑制效果。在肌动蛋白聚合检测中，SARA-cpPG同样能有效抑制TGF-β1诱导的肌动蛋白丝重组，使其恢复至接近未刺激状态，而对照化合物则不能。

关于SARA-cpPG抑制TGF-β信号通路作用机制的讨论

为阐明作用机制，研究从两个层面进行了探究：一是SARA-cpPG是否抑制Smad2/3的磷酸化；二是其是否抑制磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）的核转位。Western blot分析结果显示，SARA-cpPG并不影响TGF-β1诱导的Smad2磷酸化水平，这与LY2157299的作用模式不同，后者完全阻断了磷酸化。因此，机制（I）——抑制磷酸化被排除。

随后，利用含有Smad结合元件（SBE）的荧光素酶报告基因系统评估了SARA-cpPG对TGF-β响应基因转录的影响。实验表明，SARA-cpPG能显著抑制TGF-β1诱导的荧光素酶活性升高，而SARAm-cpPG和SARA-R8则无此效果。这证实了SARA-cpPG通过结合胞质中的Smad2/3（及p-Smad2/3），并借助cpPG载体固有的胞质定位特性，阻断了p-Smad2/3-Smad4复合物的核转位，从而抑制了下游基因转录，即机制（II）——阻断核转位。相比之下，R8载体可能将SARA肽一同带入细胞核，因而无法发挥阻断作用。

结论

该研究成功验证了细胞穿膜载体cpPG（DKDKC₁₂-K₅）可用于高效胞质递送具有生物活性的Smad2/3结合肽（SARA肽）。所形成的共轭物SARA-cpPG能有效抑制TGF-β信号通路，其作用机制是阻断磷酸化Smad2/3的核转位，而非抑制其磷酸化过程。与经典穿膜肽R8相比，cpPG在递送效率和胞质定位方面展现出优势。这为开发靶向细胞内信号分子核转位的肽类或蛋白质类疗法提供了一个有前景的平台。未来需要在更多细胞系（包括原代正常细胞和其他癌细胞）中进一步验证其普适性。