針對CD38靶點的多肽PET顯像劑設計：DIAMSAR偶聯的單體、反式單體及二聚體衍生物用於多發性骨髓瘤成像

《Bioconjugate Chemistry》：On-Resin DIAMSAR-Conjugated CD38-Targeted Peptides and Their Inverso and Dimeric-Inverso Analogs for PET Imaging of Multiple Myeloma

本研究報導了通過噬菌體展示篩選出CD38靶向肽序列HAPWFRGGGGS，並在固相合成中採用"樹脂上偶聯"策略將雙功能螯合劑DIAMSAR與肽連接。為提升穩定性與親和力，進一步設計了全D-胺基酸的反式單體(Monomer_D)及二聚體(Dimer_D)衍生物。[64Cu]Cu-Dimer_D展現出優異的血清穩定性、更高的親和力及顯著的體內靶向能力，在兩種多發性骨髓瘤(MM)動物模型中均實現了清晰的腫瘤顯像，為MM的分子靶向PET成像提供了具轉化前景的新型探針。

　　

引言

多發性骨髓瘤(MM)是一種無法治癒的漿細胞惡性腫瘤，其生物學特性和臨床病程具有異質性，凸顯了分子靶向成像對於輔助治療選擇和療效評估的重要性。分化簇38(CD38)是一種約45 kDa的II型跨膜糖蛋白，在多發性骨髓瘤(MM)漿細胞中高度且持續表達，而在正常和非造血組織中表達有限，因此成為MM成像和治療的重要靶點。儘管[¹⁸F]FDG PET/CT廣泛用於MM分期和療效評估，但其可變的糖酵解親和力、瀰漫性骨髓受累以及炎症相關攝取可能降低病變檢出率和特異性，這推動了靶點特異性示蹤劑的開發。與單克隆抗體相比，肽類放射性藥物具有體積小、血液清除快、易於化學修飾以及具有高親和力和特異性潛力等優勢。

結果

合成與分子對接

研究通過自動Fmoc固相肽合成(SPPS)成功製備了單體L型(Monomer_L， DIAMSAR-PEG₄-HAPWFRGGGGS)、反式單體D型(Monomer_D， DIAMSAR-PEG₄-hapwfrggggs)和二聚體D型(Dimer_D， DIAMSAR-(PEG₄-hapwfrggggs)₂)三種肽，並經半製備反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化至純度大於95%。分子對接結果顯示，所有構型均傾向於與CD38催化口袋相鄰的表面凹槽結合。Cu-Monomer_L的最低能量構象結合能為-5.6 kcal·mol^-1，而Cu-Monomer_D的結合能更低，為-8.4 kcal·mol^-1，且形成了更多氫鍵和范德華力接觸(14個對比12個)，表明D型胺基酸取代增強了分子互補性。Cu-Dimer_D的相互作用數量進一步增加至24個，結合能也進一步降低至-10.1 kcal/mol，這與親和力驅動的CD38結合增強相一致。

功能評估與放射性化學

CD38 NAD酶活性抑制實驗顯示，所有肽均能濃度依賴性地抑制CD38酶活性，其中Dimer_D的IC₅₀值最低，約為14 μM，顯著低於Monomer_L (~68 μM)和Monomer_D (~64 μM)。50值通過非線性回歸獲得。">

所有DIAMSAR偶聯肽與銅-64 (⁶⁴Cu)的放射性標記率均大於98%，表觀摩爾活度約為65 MBq/nmol。穩定性測試表明，[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_L在血清中穩定性較差，2小時後僅剩約45%完整示蹤劑。相比之下，[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D和[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D的穩定性顯著提高，4小時後仍保持大於92%的完整示蹤劑，證實D-胺基酸替代大幅增強了抗蛋白水解能力。64Cu]Cu-Monomer_L, (B) [⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D, (C) [⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D。D型及二聚體類似物在37°C下4小時內保持高度穩定。">

體外細胞攝取與飽和結合實驗

在表達CD38的人類MM MOLP2細胞中，[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D的細胞攝取率(9.24 ± 0.96%)顯著高於[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_L (5.03 ± 0.63%)，而[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D的攝取率進一步提升至17.06 ± 0.97%。所有情況下，加入過量未標記肽、達雷妥尤單抗(DARA)或伊沙妥昔單抗(ISA)均能顯著降低攝取，證實了結合的CD38特異性。d值，二聚體的B_max值顯著更高。">

飽和結合分析表明，用D-胺基酸替代L-胺基酸提高了結合親和力，使K_d從1043 nM ([⁶⁴Cu]Cu-Monomer_L)降低至約740 nM ([⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D)。二聚體類似物的K_d值與之相當(約730 nM)，但其B_max值從3024 fmol/mg ([⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D)顯著增加至6993 fmol/mg，這表明多價性帶來了親和力增強。此外，[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D在多種CD38表達細胞系(MOLP2, MOLP8, MM1.S, U266)中均表現出CD38介導的特異性攝取，並在MOLP2細胞中表現出時間依賴性的內化。

體內PET/CT成像與生物分佈

在播散性MOLP2 MM模型中，注射後2小時的PET/CT成像顯示，放射性示蹤劑在股骨處有明顯積聚，且攝取隨肽價態增加而增加。[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D的最大股骨攝取值為1.52 ± 0.35 % ID/mL，而[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D則為2.93 ± 0.68 % ID/mL，對照組小鼠則低於1% ID/mL。64Cu]Cu-Monomer_D和[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D的體內PET/CT成像及定量分析。(A,B) 注射後2小時的最大強度投影(MIP) PET圖像顯示播散性模型股骨攝取。(E) 時間-活度曲線顯示二聚體的股骨攝取更高。">

在皮下MOLP2模型中，[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D在注射後2小時即可實現清晰的腫瘤顯像，最大腫瘤攝取值達4.66 ± 0.20 % ID/mL，腫瘤與肌肉比值(T/M ratio)為10.6 ± 3.1。64Cu]Cu-Dimer_D的成像。(A) 代表性軸位PET/CT融合圖像顯示腫瘤攝取(T)。(C) 時間-活度曲線顯示皮下模型中持久的腫瘤攝取和高腫瘤-肌肉對比度。">

離體生物分佈結果驗證了成像發現。[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D在播散性模型中的股骨攝取值(2.26 ± 0.42 % ID/g)顯著高於[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D (1.68 ± 0.24 % ID/g)，其股骨與肌肉比值(18.17 ± 3.26)也遠高於後者(5.28 ± 1.52)。

自顯影

自顯影結果進一步證實了示蹤劑在腫瘤富集區域的定位。在播散性模型中，切除的股骨顯示出明顯的髓內示蹤劑積聚。在皮下模型中，切除的腫瘤顯示出[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D強烈且異質性的攝取。[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D的信號強度高於[⁶⁴Cu]Cu-Monomer_D，而對照組小鼠股骨僅有可忽略的活性，確認了CD38特異性結合。

討論

本研究描述了CD38靶向肽的合理設計與評估。研究採用了創新的"樹脂上"偶聯策略，在Fmoc-SPPS過程中直接將螯合劑DIAMSAR連接到樹脂錨定的肽上，簡化了合成流程並確保了位點特異性連接。為克服L-胺基酸肽的蛋白水解不穩定性，設計了全D-胺基酸的反式單體(Monomer_D)，其血清穩定性得到顯著改善(>92%完整，4小時)，同時保持了對CD38的結合親和力。為進一步提升性能，通過PEG₄連接子將兩個Monomer_D單元連接形成二聚體(Dimer_D)，旨在利用親和力效應增強靶標結合。

實驗數據全面支持了這一設計策略。分子對接預測Dimer_D具有更有利的結合能和更多的分子間相互作用。體外實驗證實，與Monomer_L相比，Monomer_D和Dimer_D對CD38 NAD酶活性的抑制能力更強(IC₅₀更低)。更重要的是，Dimer_D在CD38陽性細胞中表現出最高的攝取率和顯著增高的B_max值，體現了多價結合的優勢。穩定性研究表明，D型胺基酸替代和二聚化均能有效抵抗血清中的降解。

體內研究是驗證其轉化潛力的關鍵。在兩種MM動物模型(播散性和皮下)中，[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D均表現出優異的靶向能力。PET/CT成像清晰顯示了腫瘤/病變部位的示蹤劑積聚，且攝取強度和靶標與本底比值均顯著高於Monomer_D。生物分佈數據與成像結果高度一致，並顯示出快速清除和低非特異性本底的特點，這對於獲得高對比度的診斷圖像至關重要。自顯影為示蹤劑在組織層面的定位提供了直觀證據。

綜上所述，[⁶⁴Cu]Cu-Dimer_D集高摩爾活度、卓越的體內外穩定性、增強的靶向親和力以及優良的藥代動力學特性於一身，在多發性骨髓瘤模型中實現了高對比度的PET顯像。這項工作不僅證明瞭通過合理設計(包括D-胺基酸替代和二聚化)可以優化肽類放射性藥物的性能，也為開發針對CD38及其他靶點的分子影像探針提供了一個可借鑒的模塊化策略，具有重要的轉化醫學意義。