妊娠期烯酰吗啉暴露的神经毒性机制：单细胞解析揭示代谢重编程与血脑屏障功能障碍

《Environmental Science & Technology》：Single-Cell Dissection of Dimethomorph-Induced Neurotoxicity in the Gestational Brain: Metabolic Disruption and Blood–Brain Barrier Dysfunction

这篇研究运用整合单细胞转录组测序（scRNA-seq）与代谢组学技术，首次系统揭示了杀菌剂烯酰吗啉（Dimethomorph, DMM）对孕期小鼠大脑的神经毒性作用机制。研究发现，低剂量DMM暴露即可导致大脑内关键神经细胞（包括小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞）的比例和功能发生显著改变，并伴随代谢重编程和血脑屏障（Blood-Brain Barrier，BBB）功能受损。这不仅为理解农药对母胎神经发育的潜在风险提供了高分辨率机制图谱，也对未来农药安全评估和神经保护策略的开发具有重要参考价值。

研究背景与目标

农药残留，特别是对孕妇和胎儿等非目标生物的神经毒性，是环境和健康领域的重要关切。烯酰吗啉（DMM）是一种广泛使用的杀菌剂，其在正常足月妊娠孕妇脐带血中被检出。然而，关于DMM，尤其是孕期暴露引起的神经毒性，其机制尚不明确。本研究旨在利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和代谢组学技术，系统揭示DMM暴露对妊娠期小鼠大脑的细胞异质性、代谢状态和血脑屏障完整性的影响。

研究方法

研究首先收集了302例无母婴并发症的足月妊娠脐带血样本，检测到DMM的阳性率为5.96%，为后续动物实验的剂量选择提供了人体暴露依据。通过基于生理的药代动力学（PBPK）模型模拟，确定了模拟人体暴露水平的小鼠给药剂量（180 mg/kg/天）。妊娠小鼠从孕第7天（GD7）至分娩接受每日口服DMM或对照处理。在产后第3天（PD3），采集子代大脑组织进行单细胞悬浮液制备和代谢物提取。使用10× Genomics平台进行scRNA-seq，并通过Seurat、Scanpy等工具进行细胞聚类、注释和差异基因分析。同时，利用液相色谱-质谱联用技术进行非靶向代谢组学分析。最后，通过蛋白质印迹、免疫组化和行为学测试（Morris水迷宫）对关键发现进行验证。

主要发现

一、 单细胞图谱揭示大脑细胞组成变化

研究构建了妊娠期小鼠大脑的单细胞转录组图谱，鉴定出包括小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞、周细胞、神经元、神经前体细胞等在内的主要细胞类型。与对照组（NCC）相比，DMM暴露组（DMC）的细胞组成发生显著改变：内皮细胞和周细胞的比例下降，而T/B免疫细胞群比例增加。同时，多种神经细胞类型也出现变化：小胶质细胞、少突胶质细胞、星形胶质细胞和室管膜细胞的比例下调，而成纤维细胞和神经母细胞的比例上调。细胞间通讯分析显示，DMC组细胞间的相互作用网络显著增强且复杂化。

二、 关键神经细胞亚型的功能解析

1. 1.
   小胶质细胞（Microglia）：小胶质细胞被进一步分为四个亚群，包括Atf3⁺、Isg15⁺和泛小胶质细胞等。DMM暴露导致Atf3⁺小胶质细胞比例增加。差异基因分析发现，这些亚群高表达ISG15和MRC1等基因。细胞通讯分析揭示了APOE、APP、CCL和JAM等信号通路在DMC组发生改变。功能富集分析表明，Atf3⁺小胶质细胞与应激反应激活相关。标志性通路分析显示，促生长通路（如PI3K-AKT-mTOR、WNT/β-catenin）比免疫调节通路更为活化。
2. 2.
   神经母细胞（Neuroblasts）：神经母细胞被分为7个亚群，包括Cenpf⁺、Macro_like、Pbx3⁺、St18⁺和Pcp4⁺等。伪时间轨迹分析表明，Macro_like细胞处于分化初期，而Pbx3⁺细胞处于分化末期。DMC组整体基因表达呈现下调趋势。Ptgds是差异最显著的基因之一。GO分析显示Pbx3⁺神经母细胞显著富集于轴突导向、神经元投射形态发生和神经前体细胞增殖等过程。标志性通路分析揭示了增殖、代谢和应激反应相关通路的协同激活。
3. 3.
   少突胶质细胞（Oligodendrocytes）：少突胶质细胞被区分为8个转录组定义的簇，包括S100b⁺、Clu⁺、Slbp⁺、Cntn1⁺和Micro_like等亚型。差异基因分析显示，Step⁺少突胶质细胞基因显著下调，而Slup⁺亚型则上调。细胞通讯分析揭示了亚型特异的配体-受体相互作用，涉及APP加工、TGF-β信号和突触粘附分子等通路。GO分析表明S100b⁺细胞富集于细胞迁移调节、过氧化物酶活性、胶质生成和免疫调节等功能，而Clu⁺亚型则与细胞粘附功能相关。标志性通路分析显示增殖、代谢和免疫调节程序高度协调激活。
4. 4.
   星形胶质细胞（Astrocytes）与内皮/周细胞
   • •
     星形胶质细胞：鉴定出8个星形胶质细胞亚簇，包括Igsf1⁺、Myoc⁺、Trf⁺、Igfbp2⁺以及活性（aNSC）和静止（qNSC）神经干细胞。CellChat分析显示，DMC组激活了突触粘附、生长因子和细胞外基质通路，而NCC组则主要参与发育信号通路。Igfbp2⁺星形胶质细胞基因显著下调，而aNSC上调。功能分析揭示了代谢、增殖和应激反应通路的协同激活。
   • •
     内皮细胞与周细胞：作为神经血管单元的核心成分，这些细胞被分为内皮细胞、中间型和周细胞三类。DMM暴露改变了它们的分布和通讯网络。DMC组显示出涉及细胞外基质、发育调节因子和细胞粘附分子的复杂信号网络。功能分析表明，内皮亚型处于活跃的蛋白质生物合成和结构重塑状态。基因集变异分析（GSVA）证实内皮/周细胞亚型对血脑屏障功能有至关重要的调节作用。

三、 代谢组学揭示系统性代谢紊乱

非靶向代谢组学分析发现，DMM暴露导致大脑代谢谱发生显著改变。共鉴定出96种差异丰度代谢物（41种上调，55种下调）。关键变化包括：氨基酸（如L-苏氨酸）、碳水化合物（如3-磷酸甘油醛）和脂类（如皮质酮）代谢紊乱。值得注意的是，糖酵解中间产物上调，而三羧酸循环（TCA cycle）组分下调，提示细胞代谢向有氧糖酵解（Warburg效应）转变。通路富集分析进一步明确了三大核心代谢网络的改变：脂质代谢（尤其是不饱和脂肪酸和花生四烯酸代谢）、氨基酸代谢（缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸、赖氨酸降解）以及微量营养素调节（维生素B₆和谷胱甘肽代谢）。网络分析显示，谷胱甘肽和花生四烯酸通路形成中枢枢纽，通过共享代谢物相互连接。

四、 剂量-效应关系与体内验证

关键指标的分析显示出一致的剂量依赖性趋势：内皮/周细胞比例的减少、谷胱甘肽和脂质代谢通路的紊乱评分以及PI3K-AKT-mTOR通路的激活水平，均随着DMM剂量的增加而单调上升。

进一步的体内实验验证了上述发现：

1. 1.
   mTOR通路激活：蛋白质印迹分析显示，DMC组磷酸化mTOR与总mTOR的比值（p-mTOR/mTOR）显著高于NCC组。
2. 2.
   氧化应激加剧：免疫组化显示DMC组胼胝体周围8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG，氧化DNA损伤标志物）表达显著增加。同时，组织丙二醛（MDA，脂质过氧化产物）含量升高，而谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性降低。
3. 3.
   空间记忆受损：Morris水迷宫测试表明，与NCC组相比，DMC组后代小鼠在目标象限停留的时间和进入次数均显著减少，提示其空间学习和记忆能力受损。

讨论与总结

本研究首次在单细胞分辨率上系统阐明了DMM的神经毒性机制。研究发现，DMM暴露会导致大脑内多种神经细胞发生细胞类型特异性的代谢重编程和功能改变，其中小胶质细胞向促炎表型转化，少突胶质细胞和星形胶质细胞的稳态支持功能受损，内皮/周细胞功能异常导致血脑屏障完整性破坏。PI3K-AKT-mTOR信号通路的激活是连接这些表型变化的核心机制。这些变化共同导致了氧化应激水平升高，并最终损害了子代的空间认知功能。

这项研究将妊娠期DMM暴露与大脑稳态破坏建立了高分辨率的机制联系。其发现具有重要的环境和临床意义：它不仅为理解环境农用化学品如何通过同时靶向代谢、血管和免疫等多个相互依存的细胞系统来损害胎儿神经发育提供了新的机制框架，也凸显出现行主要关注急性毒性和成人暴露的监管安全评估体系，可能不足以防范本研究揭示的、发育阶段特异的神经毒性风险。因此，这项工作强调亟需重新评估农药风险评估范式，以保护孕妇和发育中的胎儿等脆弱人群免受慢性低水平环境毒物暴露所带来的潜在神经风险。