恒定pH分子动力学解析阳离子肽树枝状大分子与siRNA结合的机制与设计优化

《Journal of Chemical Information and Modeling》：Constant-pH Molecular Dynamics of Cationic Peptide Dendrimers Binding to siRNA

本文通过恒定pH分子动力学（CpHMD）模拟，深入研究了不同阳离子肽树枝状大分子（如MH18、MH47等）与小干扰RNA（siRNA）的相互作用机制。研究发现，siRNA通过静电作用主导结合，并促使树枝状大分子结构伸展、电荷增加；内体酸化（pH 5.0）可增强N端质子化，从而提升结合力。虽然疏水性更强的MH47在实验中表现出更高的表观亲和力，但单体模拟揭示其因赖氨酸（Lys）减少、电荷密度降低而结合较弱，其高亲和力可能源于更强的聚集倾向。相反，手性改变对单体结合模式影响甚微。本研究为理性设计高效核酸递送载体提供了关键的分子层面见解。

　　

引言

转染是将外源遗传物质导入真核细胞的过程，在生物技术和治疗学中至关重要。小干扰RNA（siRNA）疗法基于其与信使RNA（mRNA）的沃森-克里克碱基配对，可诱导RNA干扰沉默复合物（RISC）降解靶mRNA，实现基因沉默。然而，裸露的siRNA易受核酸酶降解、药代动力学性质差且可能引发免疫原性反应。因此，需要递送系统（如脂质体、阳离子聚合物和树枝状大分子）来保护并促进其细胞内摄取。其中，完全由氨基酸残基构成的肽树枝状大分子因其较低的细胞毒性和免疫原性，作为核酸载体展现出潜力，但其作用机制、效率及优化策略仍需阐明。

最近，两种有前景的第三代肽树枝状大分子序列MH18和MH13被发现，它们由亮氨酸（Leu）和赖氨酸（Lys）构成，分别具有四亮氨酸疏水核心或两个棕榈酰基核心。突变体MH47（将G2代的四个Lys突变为Leu）和手性改变体MH18D3（分支Lys由L型转为D型）则表现出不同的核酸结合与转染效率。由于树枝状大分子在溶液中可采取大量构象，其精确结构及与核酸相互作用的分子细节仍不明确。计算模拟方法，如恒定pH分子动力学（CpHMD），可为研究这些过程提供难以通过实验获得的分子细节。

方法

本工作使用GROMACS 2021.2软件包和Amber ff14SB力场进行模拟。由于缺乏树枝状大分子-siRNA复合物结构，研究采用基于分子动力学（MD）的对接协议获取复合物起始构型。分别构建了树枝状大分子和siRNA（序列：5‘-UUAAUUAUCUAUUCCGUACUU-3’）的模型，溶剂化后，进行了能量最小化和初始化。

生产模拟采用随机CpHMD方法，将MD的构象采样与泊松-玻尔兹曼/蒙特卡洛（PB/MC）计算提供的质子化状态采样相结合。每个CpHMD循环始于PB/MC步骤，计算每个可滴定基团在各质子化状态下的自由能，随后进行短暂的溶剂弛豫MD和20 ps的生产MD采样。此过程循环迭代。

分析包括计算树枝状大分子在siRNA双链上的位置、siRNA双螺旋的弯曲、siRNA的静电屏蔽、大沟/小沟映射、能量景观以及结合自由能。结合自由能通过pH加权的分子力学泊松-玻尔兹曼表面积（MM/PBSA）方法和Wyman–Tanford linkage模型进行估算。

结果与讨论

平衡

对MH18、MH18D3、DMH18和MH47与siRNA复合物进行的CpHMD模拟显示，复合物性质达到平衡。树枝状大分子的回转半径和电荷行为不同：电荷保持稳定，而回转半径平衡较慢且与未结合状态相比有显著偏差，表明siRNA部分扭曲了树枝状大分子的球状结构。MH47的回转半径最接近其在溶液中的值，可能因其电荷较少，siRNA施加的力较小。siRNA的均方根偏差（RMSD）和弯曲角表明，其结构未受树枝状大分子显著影响。

复合物整体稳定性通过树枝状大分子沿siRNA的位置、接触界面面积、磷酸-胺静电接触数量及静电屏蔽等性质评估。界面面积在不同序列和pH下相对恒定，表明树枝状大分子的共享拓扑结构对其适应siRNA表面的影响大于单纯静电作用。静电屏蔽分析显示，在pH 7时，MH47对siRNA磷酸基团的覆盖效率较低，因其总体电荷较少，限制了与核酸的静电相互作用数量，但通过更多疏水作用补偿。

所有树枝状大分子在pH 5和7之间的电荷存在显著差异，但多数结构性质在两种pH下未见差异，表明核酸的存在可能屏蔽了总电荷差异。

树枝状大分子与核酸界面

尽管界面面积相对恒定，但静电屏蔽分析表明，在pH 7时，MH47因总体电荷较低，覆盖siRNA磷酸基团的效率较差。这与其更高的疏水性一致，导致在pH 7时与siRNA的疏水作用更强。

肽树枝状大分子的pH滴定

计算了所有树枝状大分子在游离状态和结合siRNA状态下N端氨基的滴定曲线。赖氨酸侧链在整个模拟pH范围内基本保持质子化。N端的“表观”pK_a值提供了其质子结合亲和力的估计。结合siRNA后，所有树枝状大分子的N端pK_a值均系统性升高，且Hill系数降低，表明N端之间存在强耦合，质子结合过程具有协同性。pK_a升高可归因于这些基团与siRNA带负电的磷酸基团相互作用，稳定了其质子化形式，静电作用超过了去溶剂化效应。无论与沟槽还是磷酸基团相互作用，pK_a值均高于游离状态，证实了静电作用的主导地位。

能量景观显示，所有氨基基团都明显倾向于与磷酸基团相互作用。在pH 7时，N端在与大沟和小沟附近时倾向于去质子化，而在与磷酸基团相互作用时倾向于质子化。当与较浅的小沟相互作用时，去质子化更为明显，表明该区域提供略负的静电势，有助于稳定中性氨基基团。如图6所示，这通过MH18:siRNA复合物的结构表征得以说明，其中树枝状大分子N端与siRNA的小沟或大沟相互作用。

结合亲和力与实验数据解读

通过pH加权MM/PBSA和Wyman–Tanford linkage模型估算了结合亲和力。MM/PBSA能量分解显示，极性项高度主导，证实了树枝状大分子-siRNA相互作用的静电本质。pH效应明显，酸性增强时结合亲和力增加。MH47被识别为较弱的结合剂，因其在两个pH值下电荷较少。ΔΔG^WT–Link与ΔΔG^MMPBSA值总体吻合良好。

根据游离siRNA实验数据，MH18D3应是结合siRNA最差者，而MH47应是最好的。计算结合自由能与观察到的游离siRNA百分比之间的明显不匹配提示，游离siRNA百分比可能并不直接与单个树枝状大分子对siRNA的亲和力相关。树枝状大分子以组装纳米颗粒形式携带siRNA分子，并且以此形式通过内吞作用被细胞摄入。因此，树枝状大分子形成更高级组装体（聚集）的倾向也会影响这一指标。MH47疏水性更强，倾向于形成更大的聚集体，而MH18D3形成的聚集体最小。从单体角度来看，结合亲和力被更高阶聚集体的结合能力所超越，这些聚集体利用其增加的多价性更有效地结合siRNA分子。这有助于解释为何MH47在单体形式下是较弱的结合剂，但在更大聚集体中似乎能更有效地从溶液中捕获siRNA。

关于手性，计算模型未显示L型和D型氨基酸树枝状大分子之间存在显著差异。这表明实验数据，特别是聚集倾向，依赖于整体构象景观中微小、细微的立体特异性效应，而计算模型未能捕捉到。另一个局限性是无法提供关于树枝状大分子聚集体及其与siRNA相互作用的信息。我们通过近似聚集数（由流体动力学半径估算）并将树枝状大分子单体的行为外推至更高级组装体来解释实验数据，这可能不完全准确，因为每个树枝状大分子的聚集方式可能不同。

结论

本研究分析了不同肽树枝状大分子与siRNA分子相互作用的构型和构象景观。评估了手性、电荷密度和pH在这一相互作用中的作用。观察到siRNA结构未受树枝状大分子显著影响。然而，树枝状大分子的氨基主要与带负电的磷酸基团相互作用，诱导了更大的伸展和带电构象。这些相互作用在低pH下进一步增强，源于树枝状大分子胺基质子化的增加。此外，这种相互作用主要由树枝状大分子的N端调节，因为这些基团在生理pH值（5.0–7.0）范围内滴定并改变树枝状大分子的电荷。

尽管实验证据表明疏水性更强的树枝状大分子MH47对siRNA表现出最佳亲和力，但研究发现相反情况。研究表明，较少的Lys残基导致结合较弱，原因是总体电荷较小。通过引入不同树枝状大分子的聚集倾向，调和了实验和计算数据，这在CpHMD模拟中未能捕捉。MH47的聚集倾向非常高，这有助于解释其比其他树枝状大分子序列更能从溶液中捕获siRNA的能力。类似的解释可以说明为何手性改变的MH18D3表现较差，因为该树枝状大分子的聚集倾向最低。

研究结果表明，手性对树枝状大分子/siRNA结合模式的影响很小，这些差异难以捕捉，尤其是在单体水平。总的来说，这项工作提供了关于树枝状大分子单体与siRNA分子相互作用的关键见解，以及调节这种相互作用的潜在策略，可用于设计更高效的树枝状大分子。