微生物酮A与leptosphaerone B的全合成探索及其抗菌活性的理性评估

《Journal of Natural Products》：Total Synthesis and Biological Evaluation of Leptosphaerone B and Derivatives of Microketide A

这篇综述报道了Microketide A、B及其结构类似物leptosphaerone B的首例全合成。研究者通过模块化片段组装策略成功合成了leptosphaerone B和两个微酮A的近似物（dihydro-MikA和11-deoxy-MikA），并系统评估了它们的抗菌活性（MIC）和人类细胞毒性。研究揭示，即使对天然产物进行微小的结构修饰（如双键饱和或羟基缺失）也会导致其强效的革兰氏阴性抗菌活性完全丧失，表明该类化合物具有极其严格的结构-活性关系（SAR）。此外，化学蛋白质组学和体外亲核捕获实验证实这些骨架是内在的弱亲电试剂，难以与蛋白质发生共价作用，暗示其天然产物可能并非通过经典的迈克尔受体机制发挥作用。该研究未能最终完成Microketide A的全合成，但为深入研究这类环己烯酮类天然产物的结构-活性关系和生物潜力提供了一个稳健的合成平台。

　　

引言

在理性与人工智能(AI)指导的药物设计日益进步的背景下，天然产物仍然是开发新型抗生素先导结构的重要来源。2020年，Liu等人从珊瑚来源的海生真菌Microsphaeropsis sp. RA10-14中分离出Microketide A和B（化合物¹和²），它们是亚甲基桥联双环骨架的C-11差向异构体。据报道，它们对包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和伤寒沙门氏菌（Salmonella Typhi）在内的多种临床相关的革兰氏阴性病原体具有亚微摩尔级的强效抗菌活性。它们的核心母核——一个带有两个甲基和两个羟基的环己烯酮——也存在于另外三种真菌聚酮化合物中：leptosphaerone A和B，以及phomopine（化合物³-⁵）。鉴于微酮类化合物强大的抗菌活性、其保守的环己烯酮基序潜在的共价反应性，以及该家族天然产物与任何已知抗生素的结构差异，本研究旨在开发它们的首例全合成路线，并阐明其抗菌作用模式。

逆合成分析

研究者以合成活性最强的Microketide A（¹）为主要目标。从逆合成的角度看，关键步骤是后期将两个已功能化的片段⁶和⁷进行融合。如果该策略失败，则可尝试通过烯醇负离子烷基化将酮⁸与苄基溴⁶连接，然后在最终骨架上选择性引入α,β-双键。片段⁷可通过酮⁸的脱氢反应获得，而酮⁸则可由环己-2-烯-1-酮（¹⁰）经过α-甲基化、syn-双羟基化和缩醛保护得到二羟基酮⁹，再经过α,β-脱氢和铜酸盐的共轭加成来制备。苄基溴片段⁶可通过2,3-二甲基苯酚（¹²）经MOM（甲氧基甲基）保护和区域选择性的Wohl-Ziegler溴化反应获得。

片段合成与rac-Leptosphaerone B的制备

合成路线始于2,3-二甲基苯酚（¹²）的MOM保护，得到保护的苯酚¹¹，产率良好。随后的Wohl-Ziegler溴化反应以完全的区域选择性得到了苄基溴⁶。值得注意的是，尝试用CHCl₃或DCE（二氯乙烷）等常见替代品替代CCl₄会导致多溴化产物的复杂混合物，而通过过硫酸盐、DDQ（2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌）或CAN（硝酸铈铵）将2-位甲基区域选择性氧化为相应苯甲醛的替代路线在所有测试条件下均未成功。

片段⁷的合成从环己-2-烯-1-酮（¹⁰）的α-碘化开始，该反应通过类似Morita-Baylis-Hillman的机制，以DMAP（4-二甲氨基吡啶）为亲核催化剂，几乎定量地得到α-碘代烯酮¹³。随后的铁催化交叉偶联反应与甲基溴化镁反应，得到甲基化环己烯酮¹⁴。为了区分微酮A和B，可以选择syn-或anti-选择性双羟基化反应。对于微酮A，采用了锇催化的Upjohn双羟基化，而对于微酮B，则可以设想采用手性环氧化后进行环氧化物水解的策略。然而，研究者实现对映选择性的努力未能成功。虽然使用催化量OsO₄结合NMO（N-甲基吗啉-N-氧化物）作为再氧化剂的经典Upjohn条件可以良好地产率得到外消旋二醇¹⁵，但使用商业化的AD-mix进行Sharpless不对称双羟基化时未得到任何产物。使用可逆共价亚磺酰亚胺作为手性辅助剂进行对映选择性双羟基化的尝试也失败了，因为在热解以切除辅助基团时产物发生了分解。因此，研究者决定继续使用外消旋二醇来生产外消旋的微酮A，然后尝试通过手性HPLC（高效液相色谱）进行手性拆分。使用过量的2-甲氧基丙烯，在催化量的樟脑磺酸（CSA）存在下，以非常高的产率将二醇¹⁵保护为丙酮化合物（⁹）。为了将酮⁹脱氢为烯酮¹⁷，通过苯硒酰氯与⁹的烯醇负离子反应，在酮的α位引入了硒醚，以中等产率得到单一非对映异构体的α-硒醚¹⁶。由于立体中心在下一步会消失，因此未确定其相对构型。用过氧化氢将硒醚氧化为硒氧化物导致其自发消除，以中等产率提供了α,β-不饱和环己烯酮¹⁷。使用m-CPBA（间氯过氧苯甲酸）等替代氧化剂或添加胺碱以抑制消除副反应的文献方法均未提高产率。铜酸盐的共轭加成以良好产率得到甲基化环己酮⁸。有趣的是，当甲基溴化镁与催化量的碘化亚铜结合使用时，会形成非对映异构体的混合物（syn-⁸和anti-⁸），syn:anti比例在2:1到1:1之间。当在添加烯酮之前预先用甲基锂和氰化亚铜制备Gilman铜酸盐时，几乎只得到anti-⁸（比例1:10）。syn-⁸中β位碳的相对构型在随后的偶联步骤后通过syn-³⁵的NOESY NMR（核欧沃豪斯效应光谱核磁共振）确定。

两种非对映异构体都通过α-硒醚¹⁸进行脱氢，得到片段⁷，两步总产率为18%。或者，通过使用Gilman铜酸盐并将生成的甲基化烯醇负离子与原位制备的N-tert-butyl phenylsulfinimidoyl chloride试剂反应，可以将从烯酮¹⁷到烯酮⁷的最后三步合并为一锅转化。然而，由于产率仅略高于三步程序的总产率，且该试剂需要原位分两步制备，此路线并未显著优于三步程序。获得片段⁷后，通过在甲醇中使用氯化氢脱保护二醇，合成了外消旋的leptosphaerone B（rac-⁴）。

探索两个微酮A片段的偶联策略

为了将片段⁶和⁷融合到微酮A（²¹）的最终骨架中，研究者使用简化类似物（如马鞭草烯酮^19a或3-甲基环己烯酮^19b）为多个不同的偶联策略建立了可行条件，然后将优化后的程序应用于真实骨架。首先尝试了通过二烯醇负离子进行的碱介导偶联。虽然当苄基溴或片段⁶与马鞭草烯酮（^19a）偶联时获得了良好产率的^20a,b，但原始片段⁷在强碱性条件下发生分解，可能导致了丙酮化合物的消除。Gradillas等人开发了一种由苯硫基乙醇催化的Morita-Baylis-Hillman烷基化程序，将经典MBH反应的亲电体范围从醛扩展到烷基和苄基卤化物。然而，在所述条件下，未观察到烯酮^19a,b的任何转化，使用DMAP作为催化剂的制备α-碘代烯酮¹³的条件也未成功。使用苯甲醛²²作为亲电体，结合DABCO（1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷）和咪唑等经典MBH催化剂与马鞭草烯酮（^19a）反应，也未得到苄基醇²³。研究者推测这是由于β位甲基的空间位阻增加和给电子特性所致，Mayer等人的研究也证实了β-取代的环状烯酮比未取代的环状烯酮亲电性低几个数量级。

接下来，研究者尝试用铜酸盐与α,β-环氧酮（^24a,b）反应以获得α-烷基-β-羟基环己酮（²⁵），然后通过消除羟基来合成所需的α-烷基环己烯酮。虽然环氧化反应效果良好，但环氧化物^24a,b与所提供的任何铜酸盐均不发生反应。

替代方法是通过Negishi交叉偶联来连接片段，为此对环己烯酮⁷进行了α-碘化。由于使用碘和DMAP或吡啶的标准MBH碘化条件对高度取代且缺电子的烯酮⁷无效，研究者通过添加PIFA（苯碘双三氟乙酸盐）原位氧化生成三氟乙酰基次碘酸酯来增加反应性，同时添加BHT（丁基羟基甲苯）以抑制自由基副反应。通过这种方法，以低产率获得了²⁶。然而，苄基溴⁶的锌化以及随后苄基锌物种²⁷与碘代烯酮²⁶的Negishi反应仅导致通过Wurtz偶联形成同二聚体²⁸。为防止Wurtz偶联，苄基溴完全转化为锌物种至关重要，且为了Negishi偶联的最佳结果，需要以高浓度添加锌物种。使用苄基溴（^29a），研究者根据Metzger等人的方案优化了锌插入步骤，通过碘量滴定法测定了2.0 M的浓度，产率相当于99%。使用该锌物种（^30a）与碘代烯酮¹³进行Negishi偶联成功，得到了^31a，产率52%。然而，尽管将苯酚上的MOM保护基团替换为乙酰基（^29b）有助于提高锌插入产率，但^30b的产率无法超过20%，导致苄基锌浓度仅为0.20 M。即使在真空下通过部分蒸发溶剂额外浓缩苄基锌物种后，与碘代烯酮¹³进行的Negishi偶联反应也未成功。

与Negishi偶联类似，研究者尝试使用简化片段通过Stille偶联建立路线。虽然碘代烯酮³²的锡化以中等产率提供了α-锡基烯酮³³，且苄基溴（^29a）与³³的Stille偶联是成功的，但功能化苄基溴（⁶, ^29b）与α-锡基烯酮³³的反应未得到所需产物（^34b,c）。

由于所有将烯酮与苄基位点偶联的努力均未成功，研究者退一步决定尝试在引入α,β-双键之前先形成两个片段之间关键的C–C键，因为⁸的烯醇负离子与苯硒酰氯的偶联是有效的。当将syn-和anti-混合物甲基环己酮⁸置于LDA（二异丙基氨基锂）或氢化钠和苄基溴⁶中时，观察到只有syn-非对映异构体转化为α-苄基化产物syn-³⁵，而anti-非对映异构体未反应并被重新分离。Syn-³⁵以单一非对映异构体形式获得，新形成的立体中心的构型通过NOESY NMR确定，与β位甲基和受保护的二醇均呈anti关系。

研究者继续测试了几种将α-苄基化酮syn-³⁵脱氢的方法。之前使用的硒化反应可能由于空间位阻而在此底物上失效。使用溴化铜(II)进行的α-溴化也未成功。研究者还尝试了使用IBX（2-碘酰基苯甲酸）或Pd(TFA)₂(DMSO)₂和O₂进行直接氧化，以及制备酮的硅基烯醇醚随后通过Saegusa-Ito氧化进行脱氢硅基化，但均未得到所需产物。

微酮A类似物的合成

鉴于原始片段偶联所面临的挑战，研究者决定利用在反应前体反应性方面获得的知识，合成微酮A的近似类似物。通过这种方式，即使原始天然产物难以获得，也能获得有关微酮类化合物结构-活性关系及其可能作用模式的见解。通过对环己酮³⁵进行脱保护，研究者以外消旋体形式获得了饱和的二氢微酮类似物（rac-dihydro-MikA, ³⁸）。由于环己烯酮的碱介导二烯醇负离子烷基化通常有效，但会导致受保护的二醇分解，研究者假设缺少易发生消除反应的11位氧取代基的环己烯酮骨架应与优化条件兼容。研究者从3-甲基环己烯酮（^19b）出发合成了MOM保护的羟基环己烯酮⁴³。^19b的α-甲基化得到³⁹，然后通过硅基烯醇醚⁴⁰和环氧硅醚⁴¹进行Rubottom氧化，羟基化为α-羟基酮⁴²。随后的MOM保护以60%的高产率（四步）得到了⁴³。与苄基溴⁶的二烯醇负离子烷基化定量进行，得到⁴⁴，后者在酸性条件下脱保护，得到外消旋的11-脱氧微酮A（11-deoxy-MikA, ⁴⁶）。由于大量生成竞争性消除产物⁴⁵，脱保护产率非常低，这可以通过消除反应获得芳香性来解释。

Leptosphaerone和微酮A类似物的生物测试

获得了rac-leptosphaerone B (rac-⁴)、rac-dihydro-MikA (³⁸) 和 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶) 后，研究者着手测定它们的生物活性。令人惊讶的是，在高达200 μM的浓度下，这些化合物对与Liu等人最初报道微酮A时所用相似的广泛细菌面板均未显示出任何抗菌活性。它们在人胚胎肾细胞（HEK 293）中，在测试浓度范围内也未显示出IC₅₀（半数抑制浓度），尽管在200 μM时代谢活性略有降低。

许多天然产物通过与其细胞内的蛋白质靶标发生共价作用而发挥功能。因此，研究者尝试鉴定具有迈克尔受体的两种化合物——rac-leptosphaerone B (rac-⁴) 和 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶)——与大肠杆菌（Escherichia coli）蛋白质组中半胱氨酸的潜在共价相互作用。为此，使用了竞争性残基特异性化学蛋白质组学方法，采用碘乙酰胺炔作为全局反应性半胱氨酸探针，并使用同位素标记的脱硫生物素叠氮化物（isoDTB）标签进行富集和基于质谱（MS）的定量分析。由于未观察到任何显著富集的肽段，研究者进一步通过质谱检测了rac-leptosphaerone B (rac-⁴) 和 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶) 与10倍过量的几种基于巯基的亲核试剂（N-乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、β-巯基乙醇）以及其他亲核氨基酸（N-α-乙酰赖氨酸、N-Cbz-丝氨酸）的体外反应性。与蛋白质组学数据一致，在测试条件下未观察到任何加合物的形成，从而得出结论：这些骨架是极弱的亲电试剂，对生物靶标无反应性。鉴于Mayer等人的研究表明，远离亲电π体系的取代基对3-甲基环己烯酮的亲电性影响很小，研究者推测微酮A的亲电性与rac-leptosphaerone B (rac-⁴) 或 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶) 没有显著差异，这使得微酮A通过共价模式起作用的可能性不大。

为了识别化合物与细菌蛋白质组除共价反应性或毒性效应之外的相互作用，研究者对用化合物（rac-leptosphaerone B (rac-⁴)、rac-dihydro-MikA (³⁸)、rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶)）原位处理1小时的^{金黄色葡萄球菌}（Staphylococcus aureus）进行了全蛋白质组分析。与DMSO（二甲亚砜）对照相比，所有三种化合物一致上调的唯一蛋白质是多药外排转运蛋白MmpL。对于rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶)，STRING分析显示与二甲苯和其他芳香族化合物降解相关的蛋白质簇上调。对于其他化合物，无法对显著上调或下调的蛋白质进行功能归属。这些结果表明，所有三种化合物对^{金黄色葡萄球菌}的细胞过程均无直接影响，除了激活了清除或降解外来分子的保护机制。这与活性测定和化学蛋白质组学实验的结果一致，表明leptosphaerone B (⁴) 和微酮A的两个近似类似物（³⁸, ⁴⁶) 缺乏生物活性。

结论

综上所述，研究者成功完成了leptosphaerone B的首例外消旋全合成，并合成了微酮A的两个非常接近的类似物：rac-dihydro-MikA (³⁸) 和 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶)，它们与原始骨架的区别仅在于烯酮α,β-双键的饱和或C-11处缺少第二个羟基。尽管研究者付出了广泛努力来寻找完全功能化片段⁶和⁷融合的合适条件，但原始天然产物微酮A仍然难以获得。尽管尝试了多种偶联策略，但两个片段的连接很可能受到空间位阻的挑战，因为两个片段的邻位都有取代，同时也受到片段⁷中氧取代基为获得芳香性而发生消除反应的阻碍。

研究者检测了rac-leptosphaerone B (rac-⁴)、rac-dihydro-MikA (³⁸) 和 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶) 对多种细菌以及人胚胎肾细胞的生物活性，在高达200 μM的浓度下均未观察到活性。用高浓度化合物处理的^{金黄色葡萄球菌}全蛋白质组分析未显示蛋白质组发生变化，除了外排泵和降解簇等防御机制的上调。rac-Leptosphaerone B (rac-⁴) 和 rac-11-deoxy-MikA (⁴⁶) 在体外未与亲核氨基酸侧链形成加合物，竞争性残基特异性化学蛋白质组学也未发现大肠杆菌裂解液中蛋白质的显著共价修饰。考虑到已报道的微酮A的强效抗菌活性，令人惊讶的是，仅仅缺少非反应性迈克尔受体或一个羟基就完全丧失了杀菌能力。这表明其具有非常受限的结构灵活性，需要通过合成类似物进行进一步探索。尽管合成路线未能提供天然产物，但它为深入研究这类环己烯酮类天然产物的结构-活性关系并评估其潜力提供了一个稳健的平台。