摇匀后烘烤：一种适用于血浆和脑脊液的稳健且经济高效的蛋白质组学样品制备方法

《Clinical Proteomics》：Shake and bake: a robust and cost-effective proteomic sample preparation workflow for plasma and cerebrospinal fluid

本研究开发了一种适用于血浆和脑脊液的规模化样本制备流程，通过多亲和力树脂去除高丰度蛋白（占血浆95%）及优化Lys-C/trypsin酶解条件，显著提高蛋白质组覆盖（血浆增加80%，脑脊液65%），同时保持定量精度（CV<11%），适用于大规模神经退行性疾病如ALS的生物标志物发现。

摘要

背景

血浆和脑脊液是神经退行性疾病生物标志物的互补来源。蛋白质丰度的广泛动态范围，尤其是在血浆中，阻碍了低丰度蛋白质的检测。去除高丰度蛋白质并采用高效的酶解方法可以提高蛋白质组的覆盖度，但必须仔细优化这些方法，以确保其在大规模临床蛋白质组学研究中的重复性、通量和成本效益。

方法

我们开发了一种适用于血浆和脑脊液（CSF）的可扩展样品制备工作流程，该流程结合了高丰度蛋白质的去除、使用Lys-C和胰蛋白酶的优化酶解，以及与无标记和串联质量标签（TMTpro）定量方法的兼容性。去除高丰度蛋白质是通过使用一种含有固定抗体的多亲和树脂来实现的，这些抗体针对14种高丰度血浆蛋白质，这些蛋白质合计约占血浆总蛋白质含量的95%。我们系统地评估了蛋白质去除和酶解条件，以及脱氧胆酸盐对酶解过程的影响，同时监测了可检测蛋白质的数量和定量精度。

结果

树脂与血浆的比例≥75以及混合速度为900 rpm确保了彻底且可重复的蛋白质去除。去除高丰度蛋白质后，脑脊液中可识别蛋白质的数量增加了约65%，血浆中增加了约80%，从而使富集大脑相关蛋白质的数量增加了两倍，同时保持了相对蛋白质丰度的定量精度（中位数变异系数（CV）< 11%）。采用Lys-C/胰蛋白酶两步酶解方案在血浆中获得了最高的重复性和可检测性。向样品中添加去污剂脱氧胆酸盐对脑脊液的影响较小，仅略微提高了血浆的蛋白质组覆盖度，但降低了定量精度和通量。来自528例肌萎缩侧索硬化症（ALS）临床队列的技术重复实验显示了高重复性，样本内的CV显著低于个体间的变异。

结论

这里描述的样品制备工作流程能够实现血浆和脑脊液的高通量深度蛋白质组分析，并适用于大规模临床研究中的生物标志物发现。