《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Functional analysis and identification of miRNAs associated with lipid metabolism from milk-derived exosomes
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本篇研究聚焦奶牛乳汁中的外泌体，揭示其携带的差异miRNA（miR-423-5p与miR-125b）通过调控靶基因（APOA5与SLC27A1）通路，在奶牛乳腺上皮细胞（BMECs）的脂质合成（尤其是甘油三酯（TG）积累）与分解代谢中扮演关键角色。该工作为解析牛奶脂肪（MFP）合成的细胞间通讯机制提供了新视角，也为基于外泌体miRNA的乳品质改良策略奠定了理论基础。
引言
牛奶脂肪百分比是评估牛奶品质的关键指标之一。作为牛奶中主要的营养成分，牛奶脂肪为人类提供了优质的天然脂肪来源。高脂肪含量的牛奶口感更佳，风味更浓郁，同时也是奶油、炼乳、奶酪和黄油等加工食品的重要原料。牛奶脂肪百分比这一性状具有高度遗传性，其合成是一个动态且复杂的多网络调控过程，涉及大量基因的参与。常见的荷斯坦奶牛乳脂率通常在3.6%到4.0%之间。奶牛的脂肪代谢与合成涉及许多关键组分，包括负责从头脂肪酸合成的基因如FASN、ACACA和SCD，以及参与脂肪酸摄取、转运和活化的LPL与VLDLR等。此外，如mTOR、SREBP、PPARG和AMPK等信号通路和转录因子对乳脂代谢与合成的调控也至关重要。在乳脂代谢中，已有研究报道微小RNA可通过调控脂肪酸的合成、转运和氧化来影响奶牛乳腺上皮细胞内的脂质含量。例如，miR-29b靶向LPL和TDG，miR-2382-5p靶向NDRG2以促进BMECs中的脂质合成，而miR-423-5p则靶向FAM3A影响肝脏糖脂代谢，miR-125b靶向ACC和FASN通过脂肪酸合成途径促进肝脏脂质积累。
外泌体是纳米尺度的细胞外囊泡（30–150 nm），现被认为是细胞间通讯的关键参与者。它们源自多泡体与质膜的融合，由包括干细胞、免疫细胞和癌细胞在内的多种细胞分泌。外泌体内富含多样化的蛋白质、脂质和核酸货物。其中的mRNA、miRNA、circRNA和lncRNA具有显著的多样性，并在多种生物过程中发挥着关键作用。近期的研究表明，外泌体参与细胞间通讯、免疫反应、组织修复与再生以及脂质代谢等过程。外泌体还可以作为生物载体直接运输脂质，包括脂肪酸、类二十烷酸和胆固醇。牛奶是这些囊泡的丰富来源，其携带包括蛋白质、脂质和核酸在内的多种遗传物质，在营养输送和免疫调节中扮演重要角色。牛奶来源的外泌体miRNA有助于细胞间通讯并调节肠道微生物群，从而在脂质代谢和免疫反应等关键生物过程中发挥调控作用。例如，水牛乳外泌体通过减少脂质沉积和改善血清脂质谱，从而缓解高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质紊乱。牛奶来源的外泌体miR-148a和其他生物活性成分通过促进脂肪细胞增殖和分化，积极参与全身脂质代谢的调节。外泌体miR-11987则促进白色脂肪细胞的棕色化并增强线粒体能量代谢，从而减少体重增加，为肥胖提供了潜在的治疗策略。这些外泌体分子还有助于表观遗传调控和神经免疫调节，凸显了其多方面的生物学作用。
尽管越来越多的证据表明外泌体miRNA可以调节脂质代谢，但来自不同乳脂含量奶牛牛奶的外泌体，其miRNA组成和功能是否存在差异，目前仍不清楚。本研究旨在利用体外BMEC模型，对高、低乳脂含量奶牛牛奶来源外泌体中的miRNA进行表达谱分析和功能表征，从而为阐明其在牛奶脂肪合成中的作用提供机制性见解。
材料与方法
DHI数据收集
本研究采集了从2021年1月到2023年2月期间共计17,838条荷斯坦奶牛的DHI数据。根据泌乳阶段（早期：0–99天；中期：100–199天；后期：200–299天；末期：≥300天）进行了比较分析、方差分析（ANOVA）和相关性分析。基于这些分析，选择处于泌乳后期且分娩次数两次或以上的奶牛作为候选对象。高乳脂组的乳脂百分比高于4.5%，低乳脂组的则低于3%。
差速超速离心法分离牛奶来源外泌体
首先通过离心去除乳脂肪和脱落的乳腺上皮细胞。随后进行一系列梯度超速离心步骤（30,000 × g60分钟、50,000 × g60分钟、70,000 × g60分钟），并经过0.45 μm和0.22 μm过滤，最后在120,000 × g下离心90分钟收集外泌体沉淀。
纳米颗粒追踪分析与电镜实验
使用纳米颗粒追踪分析仪测定外泌体粒径分布。通过透射电镜观察外泌体形态，可见典型的双层膜结构的球形囊泡。
miRNA测序分析与验证
从牛奶来源外泌体中提取总RNA。小RNA测序文库由LC-Bio公司构建，并在Illumina HiSeq 2000/2500平台上进行测序。数据分析流程包括：去除接头及低质量序列、长度筛选（18–26 nt）、比对至各RNA数据库进行过滤、miRNA鉴定、差异表达分析以及靶基因预测与富集分析。差异表达的miRNA通过qRT-PCR进行验证。
外泌体摄取实验
使用PKH67试剂盒对分离的外泌体进行荧光标记，然后与BMECs共培养。通过荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察BMECs对标记外泌体的摄取情况。
载体构建
化学合成miR-423-5p和miR-125b的模拟物与抑制物。分别构建靶基因APOA5和SLC27A1的过表达载体以及相应的shRNA慢病毒敲低载体。
细胞培养与转染
使用Lipofectamine 3000将miRNA模拟物、抑制物或表达载体转染至BMECs中。
RNA提取与实时定量PCR
使用专门试剂盒提取总RNA并进行反转录。使用SYBR qPCR Master Mix进行实时定量PCR检测，以β-actin作为内参基因。
细胞内脂质成分检测
使用甘油三酯含量测定试剂盒和总胆固醇测定试剂盒等检测BMECs内的甘油三酯（TG）、总胆固醇（CHOL）及游离脂肪酸含量。
油红O与BODIPY染色
通过油红O染色和荧光染料BODIPY染色，观察BMECs内脂滴的积累情况。
EdU染色与CCK-8细胞活性检测
通过EdU细胞增殖检测试剂盒评估细胞增殖能力，使用CCK-8试剂测定细胞活性。
线粒体膜电位监测
使用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒评估细胞线粒体膜电位变化。
双荧光素酶报告基因实验
构建包含预测结合位点的野生型及突变型APOA5和SLC27A13'-UTR区的荧光素酶报告载体，与miRNA模拟物共转染BMECs，检测荧光素酶活性以验证靶向关系。
Western blot
提取外泌体及细胞总蛋白，检测外泌体标志蛋白CD9、CD81和TSG101的表达。
统计分析
使用GraphPad Prism 6软件进行统计分析，数据以平均值±标准误表示，采用单因素方差分析（ANOVA）配合Dunnett多重比较检验或Student's t检验，以*P< 0.05，**P< 0.01和***P< 0.001为差异具有统计学意义。
结果
DHI分析及高低MFP分组
对17,838条DHI记录的分析显示，泌乳产奶量随泌乳阶段推进而逐步下降。相反，牛奶脂肪百分比（MFP）、牛奶蛋白百分比（MPP）以及乳脂蛋白比则稳步上升。在泌乳后期，MFP达到4.24% ± 1.07%的显著较高水平。体细胞计数在泌乳后期增加了56.6%，且与乳脂率呈正相关。基于此，选择泌乳后期（200–299天）、体细胞计数<104cells/mL的二次分娩奶牛作为高、低乳脂百分比（HMF和LMF）分组的候选样本。
牛奶来源外泌体的分离与鉴定
通过优化后的差速离心法，从HMF和LMF组牛奶中成功分离得到两组牛奶来源外泌体（分别命名为HMF_EXO和LMF_EXO）。透射电镜显示其为典型的双层膜球形囊泡，粒径约100 nm。纳米颗粒追踪分析显示颗粒直径峰值在100–150 nm之间。Western blot证实所获囊泡表达外泌体标志蛋白CD9、CD81和TSG101。
与MFP相关的候选miRNA鉴定与筛选
对HMF_EXO和LMF_EXO两组进行miRNA测序，共鉴定出1,320个差异表达的miRNA，其中496个上调，824个下调。基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，差异miRNA的靶基因显著富集于代谢途径、PPAR信号通路等与脂质代谢相关的通路。qRT-PCR验证了21个miRNA的表达趋势与测序结果一致。
外泌体摄取与候选miRNA筛选
荧光标记的外泌体能够被BMECs有效内吞。用HMF_EXO和LMF_EXO处理BMECs后，qRT-PCR检测显示，miR-423-5p在HMF_EXO处理组中表达显著上调，而miR-125b在LMF_EXO处理组中表达最高。初步功能验证表明，miR-423-5p和miR-125b对脂质代谢有显著影响，因此被选为后续研究的候选miRNA。
牛奶来源外泌体miR-423-5p/APOA5增强BMECs脂质代谢
转染miR-423-5p模拟物可显著促进BMECs内甘油三酯（TG）和甘油的积累，同时降低总胆固醇（CHOL）含量。油红O和BODIPY染色显示，miR-423-5p过表达导致细胞内脂滴显著增多，而其抑制物则减少脂滴形成。EdU和CCK-8实验表明，miR-423-5p过表达抑制了BMECs的增殖和活性。线粒体膜电位检测发现，miR-423-5p过表达降低了线粒体膜电位。qRT-PCR分析显示，miR-423-5p过表达上调了脂肪生成基因（FASN, SREBP1）和甘油三酯合成相关基因（DGAT1, GPAM）的表达，同时下调了脂肪酸氧化标志物CPT1B的表达。双荧光素酶报告实验和表达验证表明，APOA5是miR-423-5p的功能性靶基因。进一步研究发现，过表达APOA5降低了BMECs内的TG含量并减少了脂滴积累，同时下调了脂肪生成基因（如FASN, SCD）的表达，而上调了脂肪酸氧化基因（如CPT1B）的表达，并抑制了细胞增殖。这些结果表明，外泌体miR-423-5p通过靶向抑制APOA5，促进了BMECs的脂质合成与积累。
牛奶来源外泌体miR-125b/SLC27A1抑制BMECs脂质代谢
转染miR-125b模拟物增加了BMECs内TG和甘油的含量，同时降低了CHOL含量。用LMF_EXO处理BMECs可重现miR-125b模拟物引起的TG升高趋势，而用miR-125b抑制物预处理外泌体则消除了这种效应。油红O和BODIPY染色证实，miR-125b过表达促进了脂滴沉积，而其抑制物则抑制了脂滴形成。功能实验显示，miR-125b过表达促进了BMECs的增殖和活性，并降低了线粒体膜电位。基因表达分析发现，miR-125b过表达显著下调了脂解相关基因（HSL和ATGL）和转录调节因子PPARG的表达。双荧光素酶报告实验验证了SLC27A1是miR-125b的直接靶基因。对靶基因SLC27A1的功能研究表明，其过表达降低了BMECs内的TG含量并减少了脂滴积累，同时抑制了细胞增殖，并上调了脂肪生成基因（如FASN, SCD）的表达，下调了β-氧化基因（如CPT1B）的表达。这些结果揭示，外泌体miR-125b通过靶向抑制SLC27A1，对BMECs的脂质合成和分解代谢产生拮抗作用。
讨论
乳腺不仅是一个分泌器官，也是一个高度复杂的调控系统。在乳汁合成过程中，BMECs、脂肪细胞和免疫细胞等主动分泌外泌体，这些纳米囊泡作为分子信使，携带包括miRNA在内的多种遗传物质，作为反馈信号，精确调控邻近或自身乳腺上皮细胞的功能活动，优化高能耗的脂质代谢途径。本研究通过将牛奶来源外泌体重新引入培养的BMECs进行体内外验证，发现外泌体处理显著改变了脂质代谢相关基因的表达并增强了脂滴形成，有力地支持了乳腺内存在自调控机制的观点。选择二次分娩的奶牛作为研究对象，旨在最大限度地减少非遗传因素的干扰，从而使观察到的乳脂百分比差异更有可能归因于本研究所探讨的遗传和分子机制。
高产奶牛选育的主要目标不仅是提高产奶量，也是生产具有更高经济价值和更优营养品质的牛奶。其中，乳脂百分比和乳蛋白百分比作为关键的泌乳性状，其重要性不亚于总产奶量。本研究对DHI数据的分析揭示了乳脂含量与泌乳阶段之间存在显著的正相关关系，这与以往关于泌乳中期脂质代谢的研究结果一致。值得注意的是，在泌乳后期，体细胞计数（SCC）增加了56.6%，且与乳脂百分比的升高相关（相关系数r= 0.71）。这一结果表明，乳脂合成可能通过改变参与免疫反应的酶活性来调节乳腺炎症。尽管乳脂率在泌乳末期达到峰值，但为了尽量减少炎症的混杂影响，本研究特意选择了泌乳后期（200–299天）的奶牛作为实验对象，从而为研究乳脂变异的遗传决定因素建立了稳定的样本集。
牛奶中的蛋白质和脂质含量远高于细胞培养基。为了避免大量蛋白质对外泌体纯度的干扰，本研究建立了一套优化方案，结合差速离心和0.22 μm过滤，以获得粒径合适的高纯度外泌体。PKH67标记的外泌体主要定位于BMECs的细胞质和细胞膜，这与先前关于细胞来源外泌体摄取的研究一致，表明牛奶来源的外泌体通过内吞途径被细胞摄取。外泌体的脂质保护作用可能解释了未来研究中观察到的miRNA的高效递送。此外，牛奶来源的外泌体具有高效、便捷地操纵外泌体miRNA的潜力，能够成功地将外泌体miRNA分子递送至受体细胞。外泌体内容物可以与细胞质中的靶分子相互作用。这是外泌体介导细胞间通讯并调控关键细胞过程的一种潜在机制。
外泌体miRNA测序鉴定出1,320个差异表达的miRNA，其中miR-423-5p和miR-125b分别在高、低乳脂组中特异性富集。KEGG富集分析显示，这些miRNA的靶基因显著富集于PPAR信号通路和脂肪酸延伸通路。miRNA测序分析表明，高乳脂牛奶外泌体中miR-423-5p的表达显著升高。HMF_EXO被BMECs摄取后，能产生与外源合成的miR-423-5p模拟物类似的促进TG含量的效应。这表明高乳脂组牛奶来源的外泌体富含可影响脂质代谢的miRNA，并可作为脂质代谢的生物标志物。同时，本研究也探讨了miR-125b对TG含量的抑制作用。添加LMF_EXO后，BMECs内的TG含量呈现下降趋势。进一步实验表明，将miR-125b抑制物与LMF_EXO预孵育后再添加到BMECs中，产生了“挽救”效应。将本研究在牛奶外泌体中发现的差异miRNA与既往从高、低乳脂率BMECs中提取RNA进行RNA-seq和miRNA-seq联合分析所发现的差异miRNA进行比较，发现了168个重叠的差异miRNA。值得注意的是，本研究确定的两个关键候选miRNA——miR-423-5p和miR-125b，均包含在此重叠集合中。此外，通过联合筛选发现的常见差异miRNA，如miR-30c、miR-200和miR-34，已被充分证明在脂质代谢中发挥调控作用。在BMECs与牛奶来源外泌体中观察到的截然不同的miRNA表达谱表明，外泌体中的miRNA并非全部源自BMECs，BMECs可能有选择地将特定miRNA包装进外泌体，以调节乳腺组织内的其他细胞类型。这些比较结果支持了我们的假设：即具有不同乳脂表型的奶牛会产生携带不同miRNA货物的外泌体，进而差异性地调节乳腺细胞的代谢活性。
乳腺中的各种细胞类型通过外泌体的分泌与传递，调节BMECs的乳脂合成并影响乳腺健康。本研究系统地阐明了牛奶来源的外泌体miR-423-5p和miR-125b通过APOA5/SLC27A1-SREBP1/PPARγ网络调控脂质代谢的分子机制。在BMECs中的验证结果显示，APOA5的过表达显著抑制了SREBP1和PPARγ的表达，这与SREBP1-PPARγ轴在调节脂质代谢中的核心作用一致。然而，本研究进一步阐明，APOA5通过上调CPT1B的表达来促进脂肪酸氧化。相反，干扰SLC27A1则增加了PPARγ的表达，从而通过激活GPAM和DGAT1来促进TG合成，这与AGPAT6的作用途径相似，但强调了脂肪酸摄取阶段的重要性。升高的线粒体膜电位与增强的线粒体生物能量活性相关，而其下降则反映了去极化和功能损伤。这种扰动会损害ATP合成效率并破坏TG生物合成途径，特别是催化脂肪酸与甘油酯化的二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）。综上所述，这些发现描绘了外泌体在BMECs中通过一个错综复杂的调控网络，其中miRNA靶向APOA5基因和SLC27A1对脂质代谢产生相反的影响，而这一过程从根本上受到线粒体生物能量状态的制约。本研究为理解细胞内脂质稳态提供了一个新的机制框架。本研究的局限在于仅在一个体外模型中验证了外泌体对BMECs的影响以及特定miRNA的作用机制，因此其对脂肪细胞等其他乳腺细胞类型的影响仍有待进一步研究。
本研究假设，高、低乳脂率奶牛乳汁中的外泌体在分子谱上存在显著差异。具体而言，优质高产奶牛可能产生功能上独特、质量更高的信使，这些信使积极促成优异的乳性状。这些结果为参与乳脂合成与调控的关键功能载体和调节因子提供了新的见解。这不仅加深了我们对乳脂合成调控的理论理解，也为基于外泌体miRNA标志物的乳品质早期预测以及通过调控miRNA表达实现乳成分的定向改良奠定了基础。将外泌体作为功能生物标志物纳入基因型辅助选择策略，可以显著提高育种决策的准确性和效率。利用幼龄犊牛血液样本中的这些miRNA来预测未来乳品质是一个诱人的可能性。然而，在考虑任何育种应用之前，这种方法需要进一步的验证，以确认这些miRNA在循环中的存在及其预测能力。
结论
本研究证实，牛奶来源的外泌体miRNA通过miR-423-5p/APOA5轴和miR-125b/SLC27A1轴，成为调控牛奶脂肪合成的关键调节因子。这些发现为理解牛奶脂肪组成的分子决定因素提供了关键见解，并揭示了细胞间通讯在乳腺中的核心作用。
