《Laboratory Animal Research》：Transcriptomic insights into the immune dynamics of wild-type mice challenged with SARS-CoV-2 Beta variant
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这篇综述首次对野生型小鼠感染SARS-CoV-2临床分离株（Beta变异株）的肺部进行了转录组学分析。研究揭示了感染后显著的免疫应答动态，包括上调的通路（如细胞凋亡、细胞因子反应）和关键枢纽基因（如Kif11, Ccna2, Aurkb等），并得到了RT-qPCR和多重免疫分析验证，为理解该小鼠模型中SARS-CoV-2的致病机制提供了新见解。
研究背景与模型价值
小鼠是研究SARS-CoV-2感染致病机制的有用小动物模型。然而，早期的SARS-CoV-2祖先毒株因不能利用小鼠的Ace2作为受体，导致野生型小鼠不易感。虽然表达人ACE2（hACE2）的转基因小鼠是研究的主要模型，但其感染SARS-CoV-2会诱发致命的脑炎，这在人类中并不常见。此前研究已证实，SARS-CoV-2的Beta变异株（B.1.351）能够有效感染野生型小鼠。本研究采用RNA测序（RNA-seq）技术，旨在探究Beta变异株感染野生型小鼠后肺部的转录组景观。
研究方法概览
研究通过鼻内途径感染6周龄野生型C57BL/6J小鼠，使用的毒株为SARS-CoV-2 B.1.351。在感染后第3天和第6天收集肺部样本进行RNA测序。数据分析使用了Limma-Voom软件包识别差异表达基因（DEGs），fgsea软件包进行通路富集分析，Cytoscape软件构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络并识别枢纽基因。最后，通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和多重免疫测定对RNA-seq数据进行了实验验证。
感染后基因表达的动态变化
病毒载量检测显示，感染后第3天和第6天肺部均存在SARS-CoV-2 RNA，且第6天的病毒RNA水平显著低于第3天。差异表达基因分析显示，以校正p值（Adj. P. Val.）小于0.05且绝对log2倍变化（log2FC）大于0.75为阈值，在感染后第3天鉴定出285个DEGs（273个上调，12个下调），第6天鉴定出46个DEGs（43个上调，3个下调）。DEGs数量在第6天显著减少，这与肺部病毒载量的下降趋势一致。基因表达热图分析进一步揭示，第3天时，与干扰素通路（如Mx1, Irf7, Oas家族基因）、趋化因子应答通路（如Ccl2, Ccl7）以及细胞周期相关基因（如Zbp1, Pbk）相关的基因表达显著上调。而到了第6天，与细胞死亡通路相关的基因（如Gzmb, Pbcd1）表达差异更为显著，提示早期（第3天）的炎症反应作为宿主先天防御机制启动，而后期（第6天）则可能伴随免疫介导的细胞死亡和组织损伤。
关键通路与生物过程富集
基因本体（GO）富集分析表明，感染后细胞外基质、肌原纤维和肌小节结构相关基因发生主要变化，水解酶和氧化还原酶活性相关基因也发生改变。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析显示，在第3天，内吞作用、细胞因子-细胞因子受体相互作用、Toll样受体信号、NOD样受体信号、肿瘤坏死因子（TNF）信号以及细胞衰老等关键通路显著上调。在第6天，则观察到钙信号通路、氧化磷酸化和致癌作用等通路的富集。这些通路，特别是TNF和核因子κB（NF-κB）信号通路，在SARS-CoV-2感染期间诱导下游炎症和凋亡反应中扮演重要角色。
核心枢纽基因的识别
通过对第3天和第6天共享的差异表达基因进行蛋白-蛋白相互作用网络分析，发现了三个独立的蛋白互作簇。利用CytoHubba插件的最大团中心性（MCC）算法，识别出前10个枢纽基因，包括：Prc1、Ube2c、Ccnb2、Ncapg、Aurkb、Cep55、Mki67、Dlgap5、Ccna2和Kif11。这些基因主要参与细胞周期调控、有丝分裂纺锤体形成、染色体分离和DNA复制等过程，提示SARS-CoV-2感染可能通过影响这些基本细胞进程来发挥致病作用。
实验数据验证
RT-qPCR检测验证了RNA-seq分析中关键基因的表达趋势。结果显示，感染组肺组织中Tnfa、Il6、Ccl2和Ccl3的RNA水平显著高于对照组，且第3天的表达水平普遍高于第6天。同时，多重免疫测定检测了肺部细胞因子和趋化因子的蛋白水平。与基因表达结果一致，感染后第3天，白细胞介素-6（IL-6）、CCL2、CXCL2和CXCL10的蛋白水平显著升高。此外，粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的水平也在第3天显著增加。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-5和IL-12（P70）的水平在感染后两个时间点均显著升高，而IL-4的水平则显著下降。这些数据共同证实了感染诱导了强烈的炎症反应。
讨论与意义
本研究的独特之处在于使用了不超表达ACE2的野生型C57BL/6J小鼠模型来研究SARS-CoV-2 Beta变异株的致病机制，这为研究肺特异性免疫反应提供了一个更接近生理状态的模型。研究发现，尽管感染严重程度低于ACE2转基因模型，但Beta变异株仍能引发明显的超炎症反应，其特征是促炎细胞因子和趋化因子的表达升高。研究鉴定出的枢纽基因（如Prc1、Ccnb2、Ube2c、Kif11、Aurkb）在COVID-19患者和其他肺部疾病（如矽肺）中也存在失调，提示了SARS-CoV-2感染与增殖性或纤维化肺部疾病之间存在共通的致病景观。这些发现为识别新的生物标志物和治疗靶点奠定了基础，这些靶点旨在调节病毒诱导的免疫失调和组织损伤。
结论
综上所述，本研究首次提供了野生型C57BL/6J小鼠感染非小鼠适应性的SARS-CoV-2临床分离株（B.1.351）后肺部的转录组学分析。差异基因表达模式显示了对SARS-CoV-2强烈的免疫应答，多种先天性和炎症性通路上调。与使用ACE2转基因模型相比，使用野生型小鼠模型为研究SARS-CoV-2致病机制提供了一个独特的视角，可能更真实地反映在缺乏转基因ACE2表达情况下的宿主免疫反应。这些结果强调了使用生理相关模型研究病毒致病机制和宿主免疫应答的重要性。
