《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》：Amino acids protect against methotrexate-induced hepatorenal toxicity in vitro and in vivo
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本文推荐一项针对甲氨蝶呤(MTX)治疗中常见且危及生命的肝肾毒性问题的研究。研究者探讨了谷氨酰胺(GLU)、甘氨酸(GLY)、甲硫氨酸(MET)及亮氨酸(LEU)四种氨基酸，在体外（采用大鼠原代肝细胞和肾切片）及体内（雄性SD大鼠）模型中对MTX诱导毒性的保护作用。结果显示，这些氨基酸能通过抑制凋亡（如caspase-3）、减轻炎症（如TNF-α）、缓解氧化应激（如MDA、GSH、NO）及改善组织病理学损伤，显著增强肝、肾细胞活力。研究表明，这四种氨基酸可作为MTX治疗中有前景的佐剂，通过其抗氧化、抗炎及抗凋亡机制减轻其肝肾毒性。
甲氨蝶呤（Methotrexate, MTX）是一种广泛用于治疗恶性肿瘤和自身免疫性疾病的叶酸拮抗剂和细胞毒性抗肿瘤药物。然而，其临床应用常因严重的副作用而受限，其中肝肾毒性是最为危及生命的不良反应之一。MTX引发肝毒性和肾毒性的机制复杂，涉及过量的活性氧/氮物种（ROS/RNS）生成、细胞抗氧化防御能力下降、促炎细胞因子产生以及增强脂质过氧化等，最终导致细胞损伤、炎症和凋亡。因此，寻找能够在不影响MTX疗效的前提下，有效减轻其肝肾毒性的辅助治疗策略，成为临床研究中亟待解决的关键问题。近期，一项发表在《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》上的研究，为我们提供了一种潜在的新思路：利用人体内天然存在的氨基酸作为保护剂。
针对这一难题，研究团队系统性地探讨了四种氨基酸——谷氨酰胺（GLU）、甘氨酸（GLY）、甲硫氨酸（MET）和亮氨酸（LEU）——在体外和体内模型中，对MTX诱导的肝肾毒性的保护作用及其潜在机制。这项研究的意义在于，它首次在同一个体系中综合比较了这四种氨基酸的保护效能，并深入揭示了它们通过抗氧化、抗炎和抗凋亡等多重途径发挥作用的共同机制，为开发基于氨基酸的、低毒性的MTX辅助疗法提供了坚实的实验依据。
为了回答这些问题，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是体外模型，包括采用胶原酶灌注法分离大鼠原代肝细胞进行悬浮培养，以及制备大鼠肾皮质切片进行离体孵育。这两种模型用于评估氨基酸对MTX引起的细胞活力下降、凋亡（caspase-3活性）和炎症（TNF-α水平）的直接影响。其次是体内动物模型，研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠，将其分为对照组、MTX模型组以及四个MTX联合不同氨基酸（GLU, GLY, MET, LEU）的预处理组，通过腹腔注射给药。最后是系统的生化与组织学分析，在体内实验中，通过检测血清肝肾功能指标（ALT、AST、肌酐、尿素、BUN）、组织氧化应激标志物（丙二醛MDA、还原型谷胱甘肽GSH、一氧化氮NO）以及进行肝脏和肾脏的苏木精-伊红（H&E）染色组织病理学检查，全面评估了氨基酸的全身性保护效果。
研究结果
体外肝细胞悬浮实验结果
通过台盼蓝排斥试验评估细胞活力发现，MTX (500 μM) 孵育使肝细胞活力降低了57.59%。而预先用GLU (25 mM)、GLY (25 mM)、MET (12.5 mM) 或 LEU (25 mM) 处理30分钟，能分别使细胞死亡减少13.25%、22.04%、10.31%和14.84%。
在凋亡和炎症指标方面，MTX处理使肝细胞中caspase-3活性升高超过三倍，TNF-α水平升高超过两倍。而四种氨基酸预处理均能显著下调这两种指标。其中，GLY在抑制caspase-3活性（降低72.84%）和TNF-α水平（降低54.95%）方面表现最为突出。
体外肾切片实验结果
乳酸脱氢酶（LDH）泄漏是细胞膜完整性丧失的标志。MTX (100 μM) 使肾切片的LDH泄漏增加超过三倍。四种氨基酸预处理能显著减少LDH泄漏，GLY和GLU的效果尤为明显，分别降低了63.56%和61.82%。
同样，MTX处理使肾切片中caspase-3活性增加约两倍，TNF-α水平增加超过一倍。氨基酸预处理能有效逆转这一趋势，GLY在抑制caspase-3（降低56.72%）和TNF-α（降低42.23%）方面再次显示出最强作用。
体内生化实验结果
在大鼠体内模型中，MTX (20 mg/kg/天，腹腔注射，3天) 导致血清ALT和AST活性显著升高（超过一倍），肌酐、尿素和血尿素氮（BUN）水平也显著上升，表明肝肾功能受损。预先给予四种氨基酸能不同程度地逆转这些指标的上调。例如，GLY几乎完全逆转了MTX引起的ALT和AST升高（分别降低93.2%和93.5%），并在恢复肾功能指标方面表现优异。
在氧化应激方面，MTX处理使肝和肾组织中的脂质过氧化产物MDA水平升高超过两倍，同时显著降低抗氧化剂GSH的水平（肝降低62.68%，肾降低73.14%），并升高一氧化氮（NO）水平。四种氨基酸预处理能显著降低MDA和NO水平，并提升GSH水平。其中，GLY在恢复GSH和NO至接近正常水平方面效果最为全面。
组织病理学检查结果
肝脏组织病理学显示，MTX组出现严重的肝细胞空泡化、坏死、血管充血和门静脉炎症。而氨基酸预处理组，特别是GLY组，仅表现出轻微的血管充血和炎症细胞浸润，肝组织结构接近正常。
肾脏组织病理学显示，MTX组出现严重的肾小管上皮细胞萎缩坏死、管腔扩张、炎症细胞浸润和肾小球增生。氨基酸预处理，尤其是GLY和MET组，显著减轻了这些病理损伤，仅表现为轻度的肾小管改变和炎症。
结论与讨论
本研究通过整合体外与体内实验，有力地证明了谷氨酰胺（GLU）、甘氨酸（GLY）、甲硫氨酸（MET）和亮氨酸（LEU）对甲氨蝶呤（MTX）诱导的肝肾毒性具有明确的保护作用。其保护机制是多方面的：增强细胞活力（通过台盼蓝排斥和LDH泄漏实验证实）、抑制细胞凋亡（通过下调关键执行者caspase-3的活性）、减轻炎症反应（通过降低促炎因子TNF-α的水平）以及缓解氧化应激（通过降低MDA和NO，提升GSH）。
研究指出，这四种氨基酸的保护效力存在差异。综合来看，甘氨酸（GLY）在所有评估的指标中 consistently 表现出最强的保护效果，无论是在恢复细胞活力、抑制凋亡和炎症，还是在纠正氧化应激失衡和改善组织病理损伤方面。这可能与甘氨酸已知的强效抗炎、抗凋亡和免疫调节特性有关。谷氨酰胺（GLU）和亮氨酸（LEU）也显示出显著的保护作用，而甲硫氨酸（MET）虽然在部分指标上效果稍弱，但仍展现出明确的益处。关于甲硫氨酸，文中也讨论了其潜在的肝毒性争议，指出其毒性可能与高剂量下S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的积累和ATP耗竭有关，而本研究使用的较低浓度（体内1 mg/kg/天）则显示出保护性而非毒性。
这项研究的重要意义在于，它为临床解决MTX治疗中的关键副作用——肝肾毒性——提供了一种安全、天然且可能易于转化的辅助策略。这些氨基酸本身就是人体代谢的组成部分，作为佐剂与MTX联用，有望在保持MTX抗肿瘤或免疫抑制疗效的同时，大幅降低其器官损伤风险，从而提高患者的治疗耐受性和生活质量。未来的研究可以进一步探索这些氨基酸在临床患者中的应用潜力、最佳给药方案以及与其他保护剂的联合效果。
