《Scientific Reports》：Metagenomic sequencing identifies potential respiratory pathogens in PCR-negative subset of surveillance samples
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本研究针对呼吸道病原体诊断中，多重核酸扩增检测（NAATs，如BioFire RP）和SARS-CoV-2检测呈阴性的病例样本，研究人员应用无偏倚宏基因组测序及探针捕获富集测序技术，旨在揭示其潜在病原体。结果表明，在5%的先前阴性样本中鉴定出人呼吸道病毒，如C型流感病毒（Influenza C virus）等，并成功获得了多个病毒的高覆盖度基因组序列。此项工作凸显了宏基因组学在拓宽病原体监测范围、补充现有诊断方案盲区方面的重要价值。
在全球范围内，呼吸道病原体是导致疾病负担与死亡的重要原因，新冠疫情更是将呼吸系统疾病的监测推向了前所未有的关注高度。目前，以BioFire呼吸道面板（BioFire Respiratory Panel, RP）为代表的多重症状组合核酸扩增测试（Syndromic panel multiplex nucleic acid amplification tests, NAATs）被广泛用于临床，旨在揪出那些最常见的呼吸道疾病元凶。然而，这些靶向性强的检测方法也存在其固有的局限性：它们像一张设计精密的渔网，只能捕获预先设定好的“目标鱼种”，对于那些网眼之外的、罕见的或新出现的病原体则可能“漏网”。这就留下了一个关键的科学问题：在那些经过常规标准检测（包括BioFire RP和SARS-CoV-2检测）后结果为阴性的病例样本中，是否真的“一片清净”？还是潜伏着未被识别的、潜在的致病微生物呢？
为了回答这个悬而未决的问题，研究人员开展了一项探索性研究，并最终将成果发表在了《Scientific Reports》期刊上。他们的核心策略是利用了宏基因组测序这一“大海捞针”式的强大工具。与靶向检测不同，无偏倚宏基因组测序（untargeted metagenomic sequencing）不预设目标，能够对样本中所有微生物的遗传物质进行“无差别扫描”，是一种真正意义上的病原体非靶向检测（pathogen-agnostic detection）方法。这项技术不仅有望发现未知或意外的病原体，还能在鉴定出病原体的同时，恢复其完整的基因组序列，为后续的基因组流行病学分析和变异追踪奠定基础。
研究人员为开展此项研究，主要运用了以下关键方法：首先，他们构建了两个核心样本队列进行无偏倚宏基因组测序分析，其一为305份先前经BioFire RP和SARS-CoV-2检测均为阴性的样本（阴性队列），其二为26份先前经任一诊断测试呈阳性的样本（阳性对照）。其次，为进一步提高检测灵敏度，他们对阴性队列中的78份样本额外进行了针对人类病毒的探针捕获富集测序（probe-capture enrichment sequencing）。通过对测序产生的海量数据进行生物信息学分析，以鉴定样本中是否存在人类呼吸道病原体。
研究结果揭示了一系列有趣的发现：
宏基因组测序在先前阴性样本中鉴定出人呼吸道病毒
分析显示，在305份先前阴性的样本中，有16份（占总数的5%）通过宏基因组测序技术成功鉴定出了人呼吸道病毒。这些被“重新发现”的病毒主要包括C型流感病毒（Influenza C virus）、人博卡病毒（Human Bocavirus）、鼻病毒A型和C型（Rhinovirus A and C），以及令人关注的SARS-CoV-2。这一结果直观地证明了，常规靶向检测确实存在一定的“漏检率”，部分感染病例可能因此被忽略。
病毒共识基因组的恢复与分子流行病学分析
得益于宏基因组测序的高深度，研究人员成功地为14种病毒恢复了覆盖度广度（coverage breadth）大于90%的共识基因组（consensus genome）。对这些基因组的深入分析带来了更细致的洞察：例如，从相邻郡县采集的样本中鉴定出的博卡病毒毒株显示出高度的遗传相似性，暗示可能存在局部传播链；而在不同样本中发现的鼻病毒毒株则呈现出明显的遗传差异，表明它们是独立传入的、不同的病毒谱系。这部分工作凸显了宏基因组学在获得高质量病原体基因组数据、从而支持精细分子流行病学调查方面的独特优势。
阴性队列中其他潜在致病微生物的识别
除了病毒，研究还在先前阴性的样本队列中，于21份样本里发现了单一优势的细菌或真菌物种。尽管这些微生物与呼吸道疾病的明确因果关系尚需进一步验证，但它们的出现提示我们，呼吸道感染的病因可能比想象中更为复杂，细菌或真菌的单一或共感染可能也是导致临床症状但未被常规面板检测覆盖的原因之一。
综合以上结果，本研究的结论与讨论部分清晰地强调了其多重重要意义。首先，这项研究直接证实了在标准化的多重核酸扩增检测结果为阴性的呼吸道样本中，依然存在可检出的、具有潜在致病意义的病毒和其他微生物。这明确指出了当前主流靶向诊断方法在覆盖范围上的局限性，其“阴性”结果并不等同于“无菌”或“无感染”。其次，研究展示了无偏倚宏基因组测序作为一种补充性诊断工具的强大能力。它不仅能突破靶向检测的“盲区”，发现意外或新发病原体，还能同步提供近乎完整的病原体基因组，这对于追踪传染源、分析传播链、监控病毒变异（如SARS-CoV-2的变异追踪）具有不可替代的价值。最后，对恢复的病毒基因组进行的初步分析，如揭示博卡病毒的局部传播和鼻病毒的多样输入，示范了如何将宏基因组数据转化为具体的公共卫生行动见解。总而言之，这项工作不仅为评估和弥补现有呼吸道病原体监测网络的缺口提供了实证数据，也强力论证了将宏基因组学等非靶向技术整合进未来监测体系，以构建更全面、更灵敏、更具前瞻性的全球病原体预警系统的必要性与巨大潜力。
