《Scientific Reports》：Compound heterozygous CHAT gene mutations, a missense and a splice site variant, in two siblings with congenital myasthenic syndrome
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本文报道了一对携带CHAT基因复合杂合突变（c.1231G>A错义突变与c.752+2 T>C剪接位点突变）的同胞兄妹，两人均罹患先天性肌无力综合征(CMS)。研究人员通过微小基因(minigene)实验，首次证实c.752+2 T>C突变导致外显子完全跳过。结合AlphaFold2结构预测，阐明该突变通过破坏ChAT蛋白高度保守的α螺旋核心结构域，进而导致其功能障碍，最终引发CMS临床症状。该研究深化了对CMS-CHAT发病分子机制的理解。
在人类神经肌肉接头处，神经信号的正常传递依赖于一种名为乙酰胆碱的化学递质。乙酰胆碱由运动神经末梢合成并释放，与肌肉细胞上的受体结合，从而触发肌肉收缩。胆碱乙酰转移酶 (Choline acetyltransferase, ChAT) 是催化合成乙酰胆碱的关键酶。当编码这个“关键工厂”的CHAT基因发生突变时，工厂的生产线就会出问题，导致乙酰胆碱合成不足。其结果就是信号传递中断，肌肉无法有效收缩，表现为一种罕见的遗传性疾病——先天性肌无力综合征 (Congenital myasthenic syndrome, CMS)。其中，由CHAT基因突变引起的亚型被称为CMS-CHAT，其典型临床特征包括出生时或婴儿期出现的肌张力低下，以及反复发作的呼吸暂停（呼吸停止），对患儿的生命构成严重威胁。尽管已知CHAT基因突变会导致疾病，但科学家们对于这些突变具体如何影响ChAT酶的结构和功能，尤其是对于某些罕见突变类型（如影响基因“裁剪”过程的剪接位点突变）的确切致病机制，尚缺乏深入理解。这阻碍了精准诊断和潜在治疗策略的开发。因此，深入解析CHAT基因新发突变的致病机理，具有重要的临床和科学意义。
为了回答这些问题，研究人员在《Scientific Reports》上发表了一项研究。该研究的主要技术方法包括：首先，对两名临床诊断为CMS的同胞患儿进行CHAT基因的遗传学筛查，以鉴定其携带的突变；其次，针对发现的剪接位点突变，使用微小基因(minigene)实验系统在体外模拟和分析其对基因剪接过程的影响；最后，利用AlphaFold2人工智能模型，对正常和突变导致的异常ChAT蛋白三维结构进行预测和对比分析，从结构生物学层面解释突变如何损害蛋白功能。研究样本来源于两名具有血缘关系的患者（同胞兄妹）。
研究结果
1. 患者临床与遗传学特征
通过对一对患有先天性肌无力综合征的同胞兄妹进行临床评估和遗传分析，研究人员发现两人均携带CHAT基因的复合杂合突变。这意味着他们从父母各继承了一个不同的突变等位基因。这两个突变分别是：c.1231G>A，这是一个错义突变，会导致单个氨基酸的改变；以及c.752+2 T>C，这是一个位于内含子区域的剪接位点突变，可能影响基因转录后mRNA的剪接加工过程。
2. 剪接位点突变的实验验证
为了确认c.752+2 T>C这个剪接位点突变是否真的会导致剪接异常，研究人员设计并进行了微小基因(minigene)功能实验。他们将包含该突变位点及其侧翼序列的DNA片段克隆到报告载体中，并将其转染到细胞中表达。随后，通过分析产生的RNA，他们发现含有c.752+2 T>C突变的载体，其对应的外显子在剪接过程中被完全跳过了，没有整合到最终的成熟mRNA中。这一结果为该突变的致病性提供了直接的实验证据，证明它并非无害的多态性改变，而是会导致编码蛋白质的“蓝图”出现大片段的缺失。
3. 突变导致的结构后果预测
为了探究被跳过的外显子对应的蛋白片段在ChAT酶中的功能，研究人员利用前沿的AlphaFold2人工智能蛋白结构预测工具，对正常的ChAT蛋白三维结构进行了建模分析。预测结果显示，这个被跳过的外显子所编码的氨基酸序列，在完整的ChAT蛋白中形成了一个规则的α螺旋结构。α螺旋是蛋白质中一种非常常见且稳定的二级结构，经常作为核心功能域的一部分。进一步的序列比对发现，这个α螺旋区域在不同物种（进化上高度保守，提示其在维持ChAT正常功能中起着至关重要的作用。因此，c.752+2 T>C突变导致该外显子完全跳过的直接后果，就是破坏了ChAT蛋白这个关键的、高度保守的核心α螺旋结构，从而导致酶的结构不稳定、构象异常或催化活性丧失。
研究结论与讨论
本研究通过遗传学分析、功能实验和计算结构生物学相结合的策略，系统地阐明了一对同胞兄妹所携带的CHAT基因新发复合杂合突变的致病机制。研究证实，其中c.752+2 T>C是一个典型的致病性剪接位点突变，它通过导致特定外显子完全跳过，破坏了ChAT蛋白一个高度保守的α螺旋核心结构域。这一结构破坏被认为是导致ChAT酶功能障碍、乙酰胆碱合成不足，并最终引发患者出现先天性肌无力综合征（表现为肌张力低下和呼吸暂停）的根本原因。
这项研究的重要意义在于：首先，它通过功能实验明确了c.752+2 T>C这一罕见剪接位点突变的致病性，为这例CMS-CHAT患者的临床诊断提供了坚实的分子遗传学依据，有助于实现精准医疗。其次，该研究首次揭示了由该外显子编码的α螺旋在维持ChAT蛋白结构和功能中的关键作用，深化了学界对于ChAT蛋白结构与功能关系的认知。最后，研究策略展示了将经典的遗传学分析与现代的生物信息学工具（如AlphaFold2）相结合，能够高效地解析新发基因突变的致病机理，为未来研究其他遗传病的致病突变提供了一个可借鉴的研究范式。这些发现不仅增进了对CMS发病机制的理解，也为未来探索针对性的治疗策略（如靶向特定结构域的分子矫正或药物开发）奠定了理论基础。
