《Small》：Spatiotemporal Co-Delivery of Hydrogen and Magnesium via Microneedle Patches for Neuroinflammation Modulation After Spinal Cord Injury: A Multi-Modal In Vivo Study
时空协同递送氢气与镁的微针贴片用于脊髓损伤后的神经炎症调控
脊髓损伤（SCI）是一种由创伤、缺血或压迫引起的中枢神经系统（CNS）严重病变，其全球发病率持续上升。由于成熟神经元固有的再生能力有限，患者常遭受永久性功能缺损，并带来沉重的社会经济负担。SCI的病理生理进展包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。原发性损伤涉及机械力对脊髓造成的直接结构破坏。继发性损伤始于急性期，其特征是强烈的炎症反应和氧化应激，共同形成了涉及活性氧（ROS）风暴、神经炎症级联反应和兴奋性毒性的恶性循环，从而加剧了神经功能缺损区域。
继发性损伤导致功能丧失的主要机制是缺血诱发的线粒体功能障碍，其在伤后72小时内引发显著的ROS激增。这种过度的ROS爆发会爆炸性地激活关键的炎症信号通路，特别是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子κB（NF-κB）轴，导致促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）的释放。这些细胞因子促进大量免疫效应细胞募集至损伤部位。急性期炎症风暴通过使小胶质细胞极化偏向促炎的M1表型并抑制修复性M2细胞的分化，直接导致免疫稳态失衡，最终导致神经元凋亡和胶质瘢痕形成。动物模型表明，伤后24-72小时关键窗口期内炎症反应的程度与长期神经功能预后呈显著负相关。因此，开发能够在急性期同时清除ROS并逆转炎症极化的靶向策略，已成为打破继发性损伤恶性循环的关键治疗目标。
基于这一恶性循环的病理本质，镁离子（Mg2+）因其在神经修复中的双重调节作用而成为能够打破该循环的关键因子。Mg2+通过激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路促进小胶质细胞向M2表型极化，有效抑制TNF-α释放并下调NADPH氧化酶2（NOX2）表达，从而从源头上阻断ROS再生途径。相比之下，Mg2+竞争性阻断N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）和电压门控钙通道，减少细胞内钙离子内流，从而减轻兴奋性毒性细胞死亡，并促进神经元轴突再生——这是其他免疫调节剂所不具备的独特优势。这种“免疫调节+神经再生”的双重修复机制使Mg2+能够同时应对继发性损伤的两个核心方面：抑制炎症级联反应的放大和恢复神经功能的基础。
本研究旨在开发一种时空耦合的解决方案：利用H2在急性期靶向并清除ROS风暴，从而为免疫修复创造一个治疗窗口；同时利用Mg2+在亚急性期通过M2极化重塑免疫微环境并直接促进轴突再生。为此，我们提出了一种载镁透明质酸微针系统（MN-Mg），通过协同的材料-结构-功能设计实现突破性治疗策略，解决SCI治疗中的三大临床挑战：硬脊膜穿透、氢气扩散不受控以及免疫微环境失衡。
我们假设这种“氢气阻断氧化应激启动 + 镁驱动双重修复”的协同策略将直接应对SCI后的核心病理过程。它涉及穿透硬脊膜在病变部位释放H2以清除自由基，同时Mg2+的持续释放将促进持续的免疫-神经调节。它们的时空互补性将实现对神经微环境的调节，为克服传统治疗范式的局限性提供了新途径。
微针的制备与表征
我们使用HAMA制备了微针贴片。扫描电子显微镜（SEM）显示，每个贴片由一个10×10的阵列组成。单个微针呈圆锥形，底部直径为300±15μm，高度为600±25μm，与大鼠硬脊膜的厚度范围（300-500μm）兼容。对于含镁微针，在针尖和针座表面观察到大量黑色球形颗粒。这些球形突起在SEM下观察到的直径（40±8μm）与所使用的原始镁颗粒的尺寸（40μm）相符。
嵌入Mg-MNs中的镁颗粒可以通过受限的水解反应持续释放Mg2+和H2，而HAMA的三维网络结构可以保留Mg2+和H2。为了评估Mg-MNs释放氢气和Mg2+的动力学，我们将Mg-MNs和等质量的游离镁颗粒浸入磷酸盐缓冲盐水（PBS；pH7.4，37°C）中，并动态监测7天。到第7天，Mg-MNs累计释放了84.6±1.04μmol的氢气，显著高于游离镁颗粒组。同样，Mg-MNs的累积Mg2+释放量达到11.60±0.04mg，也显著高于纯镁颗粒（3.10±0.22mg）。MN-Mg贴片的重量损失曲线显示，在最初2天内快速降解，随后进入较慢的持续阶段，这与Mg2+和H2的累积释放一致。
为了阐明MN-Mg系统增强反应性和持续释放的机制，我们使用SEM-EDS和XPS进行了多模态表面表征，以验证“空间限制”假说。首先，SEM-EDS图谱提供了表面钝化状态的视觉证据。在去离子水中浸泡3天和7天后，游离镁颗粒表面显示出密集的元素氧积累，表明快速形成了厚厚的Mg(OH)2钝化壳。与此形成鲜明对比的是，MN-Mg组内的镁颗粒在两个时间点都只显示出极少的氧信号，这表明HAMA水凝胶网络有效地限制了水的接触和氢氧化物沉淀的积累，从而抑制了壳的形成。
为了定量验证这种抗钝化效果，我们进行了XPS分析以确定降解7天后镁的表面价态。在纯镁组中，表面发生了严重氧化：金属Mg0峰仅占总Mg信号的48.11%，而氧化Mg-O峰则占主导地位，为51.89%。与此一致，O1s谱显示出高比例的晶格氧。相反，MN-Mg组表现出优异的金属镁保留。金属Mg0含量保持在69.14%，氧化Mg-O部分显著降低至30.86%。此外，MN-Mg的O1s谱显示出与纯镁组相比晶格氧比例较低的独特分布。总之，金属镁保留率约21%的差异（69.14%对48.11%）提供了确凿的定量证据，证明HAMA网络空间限制了水解反应，防止了致密钝化层的形成，确保了H2和Mg2+的持续释放。
我们发现HAMA-MN降解溶液的pH值在72小时内从7降至6.2±0.1，而含纯镁的溶液的pH值升至10.3±0.17。Mg-MNs组的pH值为8.0-8.3。这些发现表明，HAMA的酸性降解产物，特别是葡萄糖醛酸，通过反应中和了颗粒表面的Mg(OH)2。该反应降低了溶液pH值，并减少了镁表面的Mg(OH)2钝化层。因此，尽管Mg-MNs在高pH环境下H2释放减少，但在中性pH7条件下它们仍能产生大量的H2（22.6±1.12μL）。
考虑到生物脊柱必须承受日常活动的压缩力和周围组织的拉伸力的独特结构特性，生物支架的机械性能对于植入后维持损伤部位的稳定性和固定至关重要。我们使用万能试验机表征了微针的机械性能。水凝胶微针的杨氏模量约为400MPa，表明其具有良好的机械强度。为了评估微针贴片在生理条件下的机械适应性，我们测量了MN-HAMA、MN-MgCl2和MN-Mg在PBS中浸泡1小时后的杨氏模量。所有组在吸水后模量均显著降低，从约400MPa降至约40kPa。在吸水状态下，三组之间没有显著差异。该模量与天然脊髓组织的模量非常接近，表明微针可以最大限度地减少机械失配并降低植入后继发性损伤的风险。这些发现证明了我们的水凝胶基微针系统具有优异的机械顺应性和安全性。
为了评估硬脊膜穿透效率，我们将微针贴片以5N/cm2的压力施加于离体大鼠硬脊膜（厚度：420±35μm）上30秒。随后的亚甲蓝染色表明，制备的微针具有高比表面积和优异的穿刺能力，硬脊膜被完全穿透，并留下了明显的压痕标记。
HAMA基微针的生物相容性评估
为了评估各组微针贴片的生物相容性，我们首先评估了在其上培养的细胞的体外活力。活/死细胞染色结合半定量荧光分析显示，所有水凝胶组细胞的荧光强度均低于对照组。此外，CellCountingKit-8（CCK-8）检测结果显示，在共培养第1天和第3天，各组间的细胞增殖活性没有显著差异。到第5天，对照组的增殖率显著高于含镁水凝胶组。微针组与对照组之间的这种差异可能归因于细胞培养板表面更有利的机械应力微环境。尽管如此，MN-HAMA、MN-MgCl2和MN-Mg组之间没有观察到统计学差异，表明镁的掺入并未损害HAMA基质的生物相容性。
我们使用整合素β1染色进一步评估了细胞在各种水凝胶组上的粘附情况。结果表明，掺入Mg导致神经干细胞（NSCs）在微针贴片上的伪足形成显著增加，铺展长度延长，其中MN-Mg组效果最明显。作为跨膜蛋白受体，整合素在细胞外基质和细胞骨架之间的信号转导中起着至关重要的作用。这些发现表明，MN-Mg组中Mg2+和H2的协同作用促进了NSC伪足的延伸，从而为细胞生长和粘附提供了有利的平台。
然后，我们通过在大鼠皮下植入来评估各组微针贴片的体内生物相容性。植入后2周，苏木精-伊红（H&E）染色显示，所有微针贴片组和镁颗粒组的植入部位均存在少量单核炎性细胞，与MN-HAMA组相比无显著差异。这表明镁的掺入对HAMA的生物相容性影响极小。此外，对所有植入水凝胶组大鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的组织学分析显示，与对照组相比，未发现微针贴片降解产物的明显积累，也没有显著的病理异常。这些结果证实，将镁掺入HAMA贴片不会引起全身毒性，并且Mg-MNs表现出优异的生物相容性。
HAMA基微针促进小胶质细胞极化
为了评估体外免疫调节能力，我们用脂多糖（LPS）刺激RAW264.7小胶质细胞以模拟炎症微环境。我们建立了几个实验组：未处理的小胶质细胞（假手术组）、LPS处理的细胞（对照组）以及LPS处理的细胞与MN-MgCl2或MN-Mg的共培养组。共培养7天后，使用2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）探针测量细胞内ROS水平，并通过评估小胶质细胞向M1（CD86）和M2（CD206）表型的极化来评估HAMA基微针的免疫调节能力。半定量荧光分析显示，与对照组相比，MN-MgCl2组和MN-Mg组的ROS荧光强度均降低，其中MN-Mg组的强度最低。这些发现表明，Mg-MNs有效抑制细胞内ROS生成，并减轻急性炎症期的氧化应激反应。
小胶质细胞可分为促炎M1型和抗炎M2型表型。我们首先用Iba-1标记小胶质细胞，随后分别用CD86和CD206标记M1和M2表型。免疫荧光（IF）成像和半定量分析表明，MN-Mg组的CD86荧光强度显著低于其他对照组，而CD206荧光强度显著高于所有其他对照组。这些结果证实，MN-Mg组在体外有效诱导小胶质细胞向M2表型极化，并抑制其向M1表型极化，表明其具有强大的免疫调节特性。此外，我们通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测了炎症细胞因子的表达，发现MN-Mg组促炎细胞因子TNF-α的表达降低，而抗炎细胞因子IL-10的表达增加。总之，这些多方面的结果全面证明，MN-Mg组具有显著的免疫调节功能，能够显著降低ROS水平，促进小胶质细胞从M1表型向M2表型极化，并抑制炎症反应。
HAMA基微针在体外促进神经再生
中枢神经系统含有大量能够分化为神经元细胞的神经干细胞，使其成为SCI后神经元丢失的广泛认可的理想替代物。然而，SCI后继发性损伤导致的免疫微环境严重损害了NSCs向神经元的分化，突显了调节这一过程对于有效神经组织修复的重要性。我们将各种微针贴片组与NSCs共培养，并通过评估三种标记物：微管相关蛋白（Tau）、生长相关蛋白43（GAP43）和微管相关蛋白2（MAP2），来评估其诱导NSCs分化为神经元和促进轴突生长的潜力。
免疫荧光显微图像显示，对照组和MN-HAMA组中的NSCs分化能力差，轴突生长有限，细胞保持球形并成簇生长（形成神经球）。相比之下，MN-MgCl2组和MN-Mg组中的NSCs不同程度地逐渐粘附、分散并分化为神经元，显示出显著的轴突生长和相互连接。对Tau、GAP43和MAP2染色的半定量荧光分析显示，MN-MgCl2组和MN-Mg组的荧光强度均显著高于未载药的MN-HAMA组。这些发现表明，将镁颗粒掺入微针贴片可以通过Mg2+的缓慢释放持续促进NSCs的神经元分化，从而促进神经损伤后的修复。
HAMA基微针改善大鼠SCI后的运动功能和病理
我们建立了大鼠T9脊髓压迫损伤模型，并将各组微针贴片轻轻应用于损伤部位的硬脊膜表面。将大鼠分为假手术组、对照组（仅损伤）以及损伤后植入MN-HAMA、MN-MgCl2或MN-Mg的组。如实验时间线所示，在术后1、4和8周收集组织。使用Basso、Beattie、Bresnahan（BBB）运动功能评分量表和斜面试验（IPT）评分评估各组的运动功能恢复情况。
术后8周，对照组和MN-HAMA组的BBB评分分别为5.5±1.05和5.8±1.32，两者之间无显著差异。这表明大鼠在SCI后自发的神经修复能力有限，在没有干预的情况下运动功能恢复困难。相比之下，MN-Mg组在第3周的BBB评分为6.0±1.10，第4周的IPT评分为46.67±5.16，均与其他组有显著差异。到第8周，MN-Mg组的BBB评分达到14.8±1.17，IPT评分增加至59.17±3.76，表明大鼠实现了负重和协调的前肢-后肢运动。虽然MN-MgCl2组表现出部分负重能力，但步态协调性仍显著低于MN-Mg组。后肢运动功能和足迹分析证实了BBB和IPT评分。术后8周，MN-MgCl2组的大鼠表现出间歇性的足底支撑，但步态恢复不明显。相比之下，MN-Mg组的大鼠步态均匀，脚趾拖曳痕迹显著减少，前爪和后爪的旋转角度显著改善。对照组和MN-HAMA组的大鼠后肢继续拖曳。这些发现表明，MN-Mg组通过H2和Mg2+的协同作用，可能通过抑制继发性脊髓损伤和促进轴突重塑，显著改善大鼠SCI后的运动协调性。
我们进一步使用组织切片的H&E染色评估了各组SCI后的病理情况。在所有损伤组的脊髓中，压迫部位均可见组织破坏和充血，证实了模型建立成功。使用ImageJ软件对矢状位脊髓切片上空腔面积的定量分析显示，对照组和MN-HAMA组的空腔面积在术后4周和8周之间没有显著变化，证实了自发的神经修复能力有限。MN-MgCl2组的空腔面积小于对照组，表明Mg2+可以部分促进神经修复。然而，MN-Mg组显示出最显著的治疗效果，其术后8周的空腔面积显著小于所有其他组。此外，在病变边界可见新形成的毛细血管和神经纤维束。这些发现进一步支持了Mg-MNs通过持续释放H2和Mg2+发挥协同的免疫调节和神经修复作用，从而为神经修复创造了有利的微环境，并有效减少了损伤后脊髓空腔的大小。此外，为了验证我们微针设计的合理性（600μm长度），我们使用组织切片测量了大鼠脊髓硬脊膜的厚度。损伤部位硬脊膜的平均厚度为150±42μm。这表明我们的600μm微针可以有效穿透保护性的硬脊膜屏障，同时保持安全的插入深度进入背侧脊髓，避免对深层神经回路造成损伤。
HAMA基微针调节大鼠SCI后的炎症反应
SCI后，活化的炎症细胞释放促炎细胞因子，触发继发性损伤事件的级联反应，从而加剧组织损伤并阻碍神经修复。因此，评估微针贴片在体内的早期抗炎效果至关重要。为了验证MN-Mg在继发性损伤级联高峰期的抗氧化功效，我们在损伤后第3天使用DHE染色评估了受损脊髓中的ROS水平。SCI组和HAMA组在病变部位显示出强烈的红色荧光，表明急性氧化爆发特有的超氧阴离子大量积累。定量分析显示，对照组的相对荧光强度显著高于假手术组。与此形成鲜明对比的是，MN-Mg治疗显著减弱了这种急性氧化激增。与对照组相比，MN-Mg组的DHE荧光强度显著降低，接近假手术组的水平。此外，与我们第7天的观察结果一致，这种早期干预有效地防止了向持续性氧化应激的转变。总之，这些结果表明，MN-Mg作为一种有效的抗氧化系统，不仅抑制了初始的氧化风暴（第3天），而且将低氧化微环境维持到亚急性期，从而保护神经组织免受继发性变性。
为了进一步评估损伤部位的小胶质细胞极化，我们用Iba-1标记小胶质细胞，并使用诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶-1（Arg-1）分别特异性标记M1和M2表型。与假手术组相比，在对照组和所有治疗组的损伤部位观察到小胶质细胞积累增加。IF成像和半定量分析显示，尽管MN-MgCl2组与对照组和MN-HAMA组相比，iNOS荧光强度适度降低，Arg-1荧光强度升高，但MN-Mg组的iNOS荧光强度显著低于所有其他对照组，而Arg-1荧光强度显著高于所有其他对照组。这些发现与DHE荧光结果一致，表明MN-Mg具有最强的抗炎能力。
我们进一步采用流式细胞术评估了微针贴片组在体内SCI后第7天对小胶质细胞亚型的调节情况。使用CD11b作为小胶质细胞的通用标记，M1和M2表型分别用CD86和CD206标记。与对照组相比，MN-HAMA组中CD11b+/CD86+（M1）和CD11b+/CD206+（M2）双阳性小胶质细胞的比例没有显著变化。相比之下，MN-MgCl2组由于引入了Mg2+，M1小胶质细胞比例减少，M2小胶质细胞比例增加。我们设计的载镁微针系统同时释放H2和Mg2+，显著诱导了损伤部位小胶质细胞向M2表型极化，相应地，M1小胶质细胞的比例显著降低。这种效应与所有其他组相比有显著差异。总之，这些发现表明，在SCI的急性期，载镁MN-Mg系统可以有效调节免疫细胞亚型。
HAMA基微针促进大鼠SCI后的神经再生并抑制瘢痕形成
我们通过评估三个关键方面来评估载镁微针系统对体内SCI后神经组织修复和再生的影响：神经元再生和轴突发芽、星形胶质细胞活化和胶质瘢痕形成以及血管生成。鉴于中枢神经系统中NSCs的丰富性，我们首先评估了MN-Mg微针贴片募集NSCs的能力。在损伤后第4周和第8周，我们观察了各组损伤部位巢蛋白（Nestin）阳性干细胞（NSCs）的分布。在所有组中均可见迁移的内源性NSCs；然而，对照组和MN-HAMA组之间没有观察到显著差异，表明SCI后NSC的募集能力较弱，间接反映了自发神经修复能力有限。相比之下，MN-MgCl2组和MN-Mg组的荧光强度逐渐增加，半定量分析显示，在所有时间点，MN-Mg组的强度均显著高于所有其他组。这些发现表明，MN-Mg组显著增强了内源性NSCs的归巢。
SCI后，炎症诱导的继发性损伤常伴有胶质瘢痕组织的慢性包裹，这阻碍了再生神经元和轴突的穿透，从而阻碍了受损神经组织的修复。为了研究载镁微针系统对受损脊髓的再生作用，我们进一步评估了病变部位的神经元再生和胶质瘢痕形成。使用Tuj-1和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）双染色分别分析病变区域的神经元和星形胶质细胞分布。结果显示，在对照组和MN-HAMA组的损伤边界处有大量GFAP阳性星形胶质细胞积聚（表现为强烈的绿色荧光），形成了密集的胶质瘢痕，阻碍了轴突延伸和神经元迁移。同时，几乎检测不到Tuj-1阳性神经元。相比之下，MN-Mg组在损伤部位及其周围表现出GFAP阳性星形胶质细胞密度的逐渐降低，由活化星形胶质细胞形成的瘢痕边界变得越来越模糊。与此同时，有更多的Tuj-1阳性神经元浸润。随着时间的推移，这些神经元向空腔中心迁移，与远端神经元建立连接，在8周时恢复了相对完整的脊髓形态。MN-MgCl2组中Tuj-1阳性细胞的产生和GFAP表达的抑制比对照组和MN-HAMA组有所改善，但仍不及MN-Mg组。
轴突再生的程度和功能连接的修复反映了SCI后神经组织修复和运动功能恢复的程度。此外，受损脊髓区域的血管生成增强了受损神经元的血液供应，支持神经再生和髓鞘形成。我们通过使用CD31标记血管生成、神经丝重链（NFH）标记轴突、髓鞘碱性蛋白（MBP）标记少突胶质细胞来源的髓鞘以及神经调节蛋白（GAP-43）标记再生神经的轴突发芽，进一步评估了载镁微针系统在SCI中后期促进神经再生的能力。半定量荧光分析显示，在第4周和第8周，MN-Mg组中CD31阳性血管内皮细胞的数量显著高于其他组，表明血管生成旺盛，为神经组织再生提供了有利的平台。在对照组和MN-HAMA组中，NFH和MBP标记的轴突和髓鞘稀疏且不均匀地分布在损伤区域内。相比之下，MN-Mg组病变中心NFH和MBP的荧光强度显著高于其他组，并且连续性得到改善。观察到轴突从病变边界向空腔中心延伸，表明新形成的神经元轴突正在穿透脊髓空腔。在正常生理条件下，GAP-43低水平表达以维持脊髓功能，但在神经生长和再生期间其表达上调，以促进轴突延伸并增强神经可塑性和神经递质传递。MN-Mg组中GAP-43阳性细胞的数量显著高于所有其他组。
总之，这些结果共同证明，载镁微针系统促进了内源性NSCs的迁移，减少了胶质瘢痕的形成，并促进了神经元再生和血管生成，从而为SCI后受损神经组织的轴突发芽、延伸和重塑提供了有利的平台。
转录组分析揭示MN-Mg微针调节SCI后炎症的机制
我们的体内和体外结果表明，由于其独特的H2生成机制，MN-Mg组在SCI后具有优异的抗ROS和免疫调节能力。为了进一步研究载镁水凝胶微针通过H2阻断氧化应激促进SCI修复的调节机制，我们建立了大鼠T9脊髓损伤模型。将微针植入病变部位，并在急性炎症期的术后第3天收集损伤区域的脊髓组织进行转录组测序（RNA-seq）。
差异表达基因（DEGs）分析显示，与MN-MgCl2组相比，MN-Mg组有223个上调基因和347个下调基因。主成分分析（PCA）显示两组之间明显分离，表明它们的转录组谱存在显著差异。对DEGs的基因本体论（GO）富集分析显示，与MN-MgCl2组相比，MN-Mg组在“免疫系统过程”和“免疫应答”相关术语上表现出差异表达，这表明H2释放影响了SCI部位的免疫调节。此外，对DEGs的京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析表明，与“氧结合”和“神经递质转运蛋白活性”相关的通路在MN-Mg组中上调，而“MAPK通路”、“NF-κB信号通路”和“IL-6信号通路”等通路则下调。这些发现表明，MN-Mg组可能在SCI早期阶段对炎症反应产生抑制作用。
MAPK通路调节包括细胞增殖、分化、凋亡和应激反应在内的核心生物过程，并在细胞适应微环境变化中起核心作用。我们使用蛋白质印迹（WB）分析进一步阐明了MN-Mg通过MAPK通路介导免疫调节的途径。如WB结果所示，MN-Mg组与MN-HAMA组或MN-MgCl2组之间，ERK的磷酸化没有显著差异。然而，MN-Mg组中JNK和p38的磷酸化显著降低，表明MAPK通路的JNK和p38分支受到抑制。同时，下游蛋白c-Jun和c-Fos的表达也显著降低。由于激活蛋白-1（AP-1）是由c-Fos和c-Jun通过亮氨酸拉链结构形成的异源二聚体转录因子复合物，这些结果表明MN-Mg组中AP-1表达受到抑制。
AP-1是促炎反应中的关键转录因子，驱动促炎细胞因子（如IL-6、TNF-α）和趋化因子（如CXCL1、CXCL8）的表达，从而加剧炎症。为了验证MN-Mg通过H2抑制小胶质细胞中MAPK/AP-1轴以减少促炎细胞因子释放和抑制炎症的机制，我们通过添加AP-1激动剂15(S)-HPETE来激活MN-Mg组中的AP-1。结果显示，AP-1的组成部分c-Fos和c-Jun的蛋白表达显著增强，证实了AP-1的活化。与MN-HAMA组和MN-MgCl2组相比，MN-Mg组中促炎因子IL-6和CXCL1的表达显著降低。相反，在MN-Mg+AP-1激动剂组中，它们的表达明显升高。为了进一步阐明AP-1对小胶质细胞免疫调节的影响，我们使用DCFH-DA探针测量了细胞内ROS水平。结果显示，MN-Mg组中AP-1的活化显著减弱了其清除ROS的能力，与单独的MN-Mg组相比显示出明显差异。流式细胞术进一步揭示了M1/M2小胶质细胞亚型比例的变化。与MN-Mg组相比，AP-1活化导致M1小胶质细胞比例显著增加，M2小胶质细胞比例显著下降。
这些结果表明，MN-Mg组通过H2抑制MAPK通路，进而抑制AP-1，从而下调IL-6和CXCL1的表达，阻断小胶质细胞中的氧化应激，并抑制炎症反应。
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