冷适应微生物在联苯生物降解中的应用：对环境温度波动的响应机制

《Journal of Environmental Sciences》：The application of cold-adapted microorganisms in biphenyl biodegradation: Responses and mechanisms to environmental temperature fluctuations

生物修复中低温适应菌降解多环芳烃的研究，通过极地土壤、深海沉积物等极端环境分离出22株 biphenyl 降解菌，其中 Microbacterium sp. PA5 在30和15℃均高效降解 biphenyl 并转化其他苯系物，其膜流动性调节及冷休克蛋白基因表达机制使其在昼夜温差环境中稳定。

　　

刘泽帆|黄金鸥|李伟|贾洋洋|傅玉龙|沈超峰

浙江大学环境与资源科学学院环境工程系，中国杭州310058

摘要

在受污染场地的生物修复过程中，生物强化效果的效率取决于引入的降解菌株在环境中的存活能力。许多分离出的菌株在实地应用后表现出较低的活性，主要是由于环境条件的变化，其中昼夜温度变化是一个重要的影响因素。本研究采用了适应低温的细菌来降解联苯，并考虑了实际的环境温度波动。研究采用了一种简化的分离方法——限制稀释法，从四种极端环境中分离出了22株能够降解联苯的菌株：南极土壤、太平洋深海沉积物以及青藏高原的土壤/湖泊沉积物。值得注意的是，一种来自深海沉积物的Microbacterium菌株表现出广泛的温度适应性，在30°C和15°C的温度下都能在3天内完全去除500毫克/升的联苯。该菌株还能降解甲苯、苯酚和苯甲酸钠。在实际环境水样中，其对联苯的去除效率并未受到昼夜温度循环的影响。进一步分析表明，该菌株能够在15°C下保持膜流动性，并上调了冷休克蛋白基因cspA的表达。这些结果表明，适应低温的微生物在有机污染物的生物修复中具有广阔的应用前景。

引言

地球有85%的区域常年或季节性处于寒冷状态。极地、高原和深海大部分时间都很寒冷，而温带地区则因季节变化或昼夜循环而经历低温（Hassan等人，2016年）。例如，许多中纬度地区的日温差可达10-15°C（Wang等人，2014年）。有机污染普遍存在，即使在寒冷地区也是如此。例如，南极生态系统中也检测到了高水平的联苯和多氯联苯（PCBs）（Bhardwaj等人，2018年）。此外，含有联苯作为常见成分的石油污染在青藏高原的许多地区也很普遍（Teng等人，2021年）。对于受联苯污染的场地，传统的物理和化学修复方法成本高昂且容易引发二次污染。生物修复被认为是一种经济、高效且环保的替代方案（Xu等人，2021年）。参与联苯降解的过氧化物酶也可以降解PCBs（Colbert等人，2013年）。20世纪70年代，首次发现能够降解联苯的微生物可以降解PCBs的同系物（Ahmed和Focht，1973年）。此后，从各国土壤中分离出了越来越多的能够降解联苯和PCBs的细菌菌株（Egorova等人，2021年），如Burkholderia xenovorans LB400和Rhodococcus jostii RHA1（Masai等人，1995年；Ponce等人，2011年；Atago等人，2016年）。然而，迄今为止报道的大多数能够降解联苯和PCBs的细菌都是中温菌，在低温环境下活性较低或无法生长（Mohn等人，1997年；Michaud等人，2007年；Papale等人，2017年）。它们的修复效率在受到昼夜或季节性温度循环影响的温带地区也会受到影响。

越来越多的证据表明，生物强化的效率取决于微生物菌株在环境基质中的存活能力和活性。许多非生物因素（如温度、酸碱度、盐度等）会损害微生物的生存能力，而生物因素同时影响它们的定植特性（Luo等人，2019年；Krucon等人，2024年）。具体来说，接种的微生物必须能够成功定植于当地的微生物群落并占据稳定的生态位。现有研究表明，环境扰动会对微生物的降解效率产生负面影响（Ling等人，2024年；Wang等人，2024年；Yaqoubi等人，2025年）。在实际的温度波动下保持高微生物活性仍然是一个关键挑战。在这种情况下，极端微生物——能够在极端条件下生存的生物——在生物修复应用中显示出巨大的潜力。

嗜冷菌和低温菌是能够耐受低温的微生物。嗜冷菌的最佳生长温度为15°C或更低，最高生长温度低于20°C（Gounot，1986年；Kato等人，2001年）。在寒冷地区分离出能够降解联苯的低温菌对于修复低温地区的联苯或PCBs污染场地至关重要。具有更广泛温度适应性的低温菌则适用于更广泛的污染场地。

许多研究者使用非培养方法证明了寒冷地区存在丰富的微生物资源。然而，关于能够降解有机污染物的适应低温菌株的分离研究仍然有限（Neufeld和Mohn，2005年；Baker等人，2021年）。传统的分离污染物降解细菌菌株的方法需要通过多代富集培养，然后在固体培养基上进行纯化。这一过程耗时较长，且无法防止细菌物种之间的竞争。相比之下，单细胞分离技术可以选择性培养单个细胞，消除种间竞争，从而缩短分离所需时间（Overmann等人，2017年；Huys和Raes等人，2018年；Zhu等人，2022年）。然而，单细胞分离技术通常需要昂贵的设备或专用材料。作为一种更简单的替代方法，限制稀释法可以有效确保大多数分离出的微生物来自单个细胞（Zhang等人，2021年；Jia等人，2022年）。该方法通过控制细胞接种密度实现单细胞分离。根据泊松分布将细胞悬浮液稀释后分配到细胞培养板的不同孔中，确保某些孔中只含有一个细胞。虽然这种方法已用于干细胞筛选（Chang等人，2006年；Yoon等人，2011年；He等人，2016年），但其在分离污染物降解细菌中的应用较少见。

在本研究中，使用简单的限制稀释法从四种不同的寒冷环境样本中分离出了22株能够降解联苯的细菌菌株。验证了这些菌株在30°C和15°C下利用联苯的能力。鉴定出一种具有高联苯去除效率的Microbacterium菌株PA5，并研究了其代谢其他外源物质（如苯甲酸盐）的能力。我们证实，其在实际环境水样中的联苯去除效率未受到温度变化的影响。我们还探讨了其低温适应机制，重点关注细胞膜流动性和编码冷休克蛋白的基因表达。

样本

土壤样本来自南极长城湾（62°S，58°W），温度为-3.4°C。土壤样本来自西藏拉萨（29°N，91°E），海拔4770米，温度为7.4°C。沉积物样本来自青海的Gaskule湖（38°N，91°E），海拔2856米，温度为4.8°C，以及来自太平洋（20°N，157°E），水深5443米，温度为2.0°C。

初始细菌溶液的分离

首先将1克样品与15毫升胆酸钠混合

降解联苯的细菌的分离

基于富集培养的传统功能性细菌分离方法存在处理时间较长和易受种间竞争影响的挑战。本研究采用了该研究小组之前开发的一种简单的单细胞水平分离方法（Jia等人，2022年），从环境样本中分离出能够降解联苯的细菌。该方法通过限制稀释将单个或小簇细胞接种到微孔板的不同孔中。

讨论

目前关于适应低温的降解联苯或PCBs的细菌的报道较少（Mohn等人，1997年；Papale等人，2017年）。现有的研究要么没有探讨适应低温菌株在中温条件下的降解能力（Michaud等人，2007年），要么表明适应低温的菌株在低温（15-22°C）下的降解效率较低（Master等人，2005年）。本研究中获得的PA5是唯一一种能够在低温下有效去除联苯的菌株

结论

除了常年寒冷的地区外，由于昼夜温度波动和季节性降温，许多温带地区的微生物修复效率也会降低。目前，报道的能够降解有机污染物的适应低温菌株很少，且没有记录显示能够在中温和低温条件下同时降解联苯的菌株。本研究从四种不同环境中分离出了22株能够降解联苯的微生物，属于12个属

未引用的参考文献

Cui等人，2023年；Dhillon等人，2004年；Disdier等人，2000年；Dmochewitz和Ballschmiter，1988年；Gesheva，2009年；Hirose等人，2019年；Jiang等人，2021年；Kato等人，2021年；Maucourt等人，2023年；Miao等人，2016年；Mishra等人，2009年；Neiderberger等人，2008年；Pan等人，2011年；Rather，2021年；Semenova等人，2022年；Spaniol等人，2011年；Su等人，2015年；Tigini等人，2009年；Vega-Celedón等人，2021年；Wallner等人，1997年；Wang等人，2016年；Zhu等人，2009年

CRediT作者贡献声明

刘泽帆：撰写——初稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、概念化。黄金鸥：撰写——初稿、方法学、数据分析。李伟：验证、方法学、研究。贾洋洋：软件、数据分析。傅玉龙：撰写——审稿与编辑、方法学、数据分析、概念化。沈超峰：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、资金申请

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了浙江省自然资源厅2022年科技项目（编号2022-64）、浙江省科学技术基金（编号2021C03167）和中国国家自然科学基金（编号42077125）的支持。我们感谢浙江大学的张清宇博士和中国科学院生态环境科学研究中心的傅建杰博士在土壤采样方面的协调工作。