《Journal of Food Composition and Analysis》：Offline three-dimensional chromatography coupled with high-definition data-independent acquisition of ion mobility quadrupole time-of-flight mass spectrometry enabling the multicomponent characterization of
Centella asiatica
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本研究针对中药/功能性食品中复杂代谢物表征面临的共流出、异构体难区分、新化合物发现效率低等难题，提出并验证了一种离线三维液相色谱(IEC-HILIC-RPC)与高分辨离子淌度四极杆飞行时间质谱(IM-QTOF-MS)联用的系统性解决方案。研究团队以积雪草(Centella asiatica)为对象，通过该集成平台并结合UNIFI?自动注释与GNPS分子网络分析，成功鉴定或初步表征了170种化合物，包括23个潜在新三萜；同时，利用碰撞截面(CCS)值的测定与预测，有效区分了七组同分异构体。该方法为功能食品原料中未知活性成分的高效发现与可靠鉴定提供了坚实的方法学框架。
在功能性食品和中药现代化研究的浪潮中，如何从化学成分极其复杂的植物提取物中，像大海捞针一样精准、全面地找到并识别出那些微量的、未知的、甚至是结构极其相似的“有效分子”，一直是科学家们面临的巨大挑战。传统的一维色谱技术往往力不从心，而即便是先进的质谱，面对蜂拥而至、难以分开的化合物群体，也常常“看花了眼”。积雪草，这种被誉为“美容草”、“记忆草”的药用植物，其富含的三萜和黄酮类成分具有广泛的生物活性，但其中组分共流出严重、同分异构体众多，且缺乏对照品，极大地限制了对其中新型功效成分的深入挖掘。为了打破这一瓶颈，一支来自天津中医药大学的研究团队迎难而上，他们发展了一套强大的“组合拳”技术，对积雪草的化学成分进行了一次前所未有的深度“普查”和“身份鉴定”，相关成果发表在《Journal of Food Composition and Analysis》上。
为了攻克上述难题，研究人员运用了几个关键技术方法：首先，构建了一套离线的三维液相色谱系统，依次采用离子交换色谱(IEC)对总提取物进行初步分组，再通过亲水作用色谱(HILIC)和反相色谱(RPC)进行正交分离，显著提升了峰容量。其次，采用配备离子淌度分离的高分辨四极杆飞行时间质谱(IM-QTOF-MS)，在负离子模式下进行高覆盖度的数据非依赖采集(HDMSE)，以获得高质量的MS/MS谱图。此外，研究利用UNIFI?软件结合自建化合物库进行自动峰注释，并借助全球天然产物社会分子网络(GNPS)平台进行分子网络分析，以快速发现结构类似物。最后，引入碰撞截面(CCS)值的测定与在线预测工具(AllCCS)，为同分异构体的区分提供补充证据。所用积雪草药材采自中国河北安国市。
3. 结果与讨论
3.1. 离线3D-LC/IM-QTOF-MS方法的建立
研究人员首先系统优化了每一维色谱的分离条件。通过筛选22种商品化色谱柱，最终选定Luna Omega Polar C18柱作为第三维反相色谱(RPC)的固定相，其对积雪草主要成分的分离效果最佳。第一维离子交换色谱(IEC)采用SAX柱，在优化流动相比例后，成功将三萜类(CATs)与黄酮类(CAFs)化合物分成了两个清晰的馏分。第二维亲水作用色谱(HILIC)则通过计算与第三维RPC的线性回归决定系数(R2)，筛选出正交性最佳的XAmide柱。质谱检测条件方面，通过单因素实验优化了毛细管电压、锥孔电压和碰撞能量，最终确定了能兼顾响应强度和碎片信息量的最佳参数。
3.2. 所建立离线3D-LC/IM-QTOF-MS方法的验证
通过对日内/日间精密度和重复性的考察，验证了该方法用于定性分析的可靠性。此外，利用36个代表性成分评估了HILIC与RPC两维色谱的分离正交性，计算得出的正交度(A0)为0.44，表明该系统能有效提升对复杂组分的分离能力。
3.3. 积雪草中多组分的鉴定
3.3.1. 基于UNIFI工作流程的自动峰注释实现已知化合物的表征
通过对26个亚馏分的负离子模式HDMSE数据进行智能分析，共鉴定或初步表征了170个化合物，包括121个三萜、43个黄酮以及6个有机酸等其他成分。其中25个通过与对照品比对得到了确证。文章详细阐述了三萜类化合物（如积雪草苷、羟基积雪草苷等）常见的苷元结构和糖链连接方式（如Glc(1→6)Glc(1→4)Rha），并通过典型化合物的MS/MS谱图解析，展示了如何利用特征碎片离子（如m/z 469.16对应的去质子化寡糖链离子）进行快速识别和结构推断。
3.3.2. 基于GNPS分子网络发现潜在新化合物
利用GNPS对26个亚馏分的质谱数据构建分子网络，分析得到了两个主要的三萜类分子簇。通过对比已知节点（如asiaticoside B, m/z 973.50）的质谱信息，并结合碎片规律，成功推断了23个潜在新三萜皂苷的结构。例如，通过节点间质量数差异和特征碎片，推定了新化合物madecassic acid-OH-2Glc-Rha和11-oxo-madecassic acid-OH-Glc-Glc-Rha的存在。
3.3.3. 基于CCS预测的异构体区分
积雪草中含有大量结构相似的三萜异构体（如asiaticoside有9个异构体），常规LC-MS难以区分。本研究利用IM-QTOF-MS获得的CCS值，并结合AllCCS在线预测平台，对七组同分异构体（如m/z 971.49对应的centellosides F和G）进行了区分尝试。结果显示，预测CCS值与实验测定值的变化趋势一致，?CCS多数小于6%，表明CCS信息可作为缺乏对照品时区分异构体的有力辅助工具。
4. 结论
本研究成功建立并验证了一种离线三维液相色谱耦合离子淌度高分辨质谱的系统性方法，用于积雪草的深度代谢物表征。优化的正交分离显著提升了共流出组分的分辨率，而UNIFI?自动注释、GNPS分子网络与CCS预测的整合，则实现了对170个化合物（包括23个潜在新三萜）的高效、可靠鉴定与表征。该方法不仅为积雪草的化学成分研究提供了更全面的视角，更重要的是，它建立了一个稳健的方法学框架。该框架将多维分离、高覆盖质谱检测与智能数据分析有机结合，有望推广应用于其他复杂功能性草药体系，从而加速食品和药物开发中未知活性成分的发现与鉴定进程。
