桑椹黄酮高效提取与多组分同步分析方法的建立与优化研究

《Journal of Food Composition and Analysis》：Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction and Development of an HPLC Method for Simultaneous Determination of Thirteen Flavonoids in Mulberry ( Fructus Mori)

本研究针对桑椹中具有重要生物活性的黄酮类化合物，系统优化了超声辅助提取工艺并建立了一种高效液相色谱（HPLC）同步检测方法。通过响应面法优化，以80%乙醇为溶剂、料液比1:2.5、40℃、提取60分钟的温和条件，获得了高达84.96%的总黄酮提取率；同时，所建立的C18柱梯度洗脱双波长HPLC方法可一次性分离鉴定芦丁、槲皮素等13种黄酮组分，具备良好的稳定性和重现性。该研究为桑椹活性物质的标准化、高效率取与分析提供了可靠的方法学参考和技术框架。

桑椹（Fructus Mori）自古以来就是药食同源的佳品，不仅味道酸甜可口，现代研究更揭示其蕴藏着丰富的“宝藏”——黄酮类化合物。这些天然活性物质像一支隐藏在果实中的微型护卫队，展现出强大的抗氧化、抗炎、降血糖等多种生物活性，使其在功能食品、药品和化妆品领域备受青睐。然而，如何将这些宝贵的活性成分高效地从桑椹中“请”出来，并精确地“清点”其种类和含量，一直是制约桑椹深度开发和品质控制的关键难题。传统的提取方法要么耗时费力、效率低下，要么可能因高温导致热敏性成分“牺牲”；而常用的检测手段又往往像视力不佳的“侦探”，难以同时识别并量化复杂的多组分黄酮“家族”。面对这些挑战，一项发表于《Journal of Food Composition and Analysis》的研究提供了一套创新的解决方案。

为了攻克上述难题，研究人员开展了一项题为“Optimization of Ultrasound-Assisted Extraction and Development of an HPLC Method for Simultaneous Determination of Thirteen Flavonoids in Mulberry (Fructus Mori)”的研究。研究首先聚焦于优化提取工艺，核心目标是找到一条高效、温和且可重复的提取路径。为此，团队利用超声辅助提取技术，以其独特的空化效应来温和破碎细胞壁、促进成分溶出。研究通过系统的单因素实验，初步探索了溶剂（甲醇、乙醇、水）、浓度、温度、时间和料液比等因素对提取率的影响。在此基础之上，研究进一步运用了精密的实验设计工具——三因素三水平的Box-Behnken响应面设计，对关键变量（提取时间、料液比、温度）进行精细建模和优化，以数学模型预测最高提取率的“黄金参数”。在分析端，研究的另一大亮点是建立并验证了一种全新的高效液相色谱（HPLC）检测方法。该方法采用C18色谱柱和梯度洗脱程序，并创新性地设置290 nm和365 nm双波长检测，旨在一次进样就能将13种结构相近的黄酮类标准品基线分离，并准确定量其在桑椹实际样品中的含量。整个方法经过了严格的线性、精密度、回收率、检测限和定量限等验证，以确保数据的可靠性。

主要技术方法：本研究整合了工艺优化与分析检测两大模块。关键方法包括：1. 超声辅助提取（UAE）工艺优化：采用单因素实验与响应面法（RSM）相结合的实验设计，系统优化了以80%乙醇为溶剂的提取条件（时间、温度、料液比）。2. 高效液相色谱（HPLC）多组分分析方法开发：建立了基于C18色谱柱的梯度洗脱方法，采用双波长（290/365 nm）检测，实现了13种黄酮类化合物的同步分离与鉴定。3. 方法学验证：对所建立的HPLC方法进行了全面的验证，包括线性范围、精密度（日内、日间）、准确度（加标回收率）、检测限（LOD）和定量限（LOQ）的测定。研究所用的桑椹样本（品种“中申一号”）采集自位于中国江苏省镇江市的中国农业科学院蚕业研究所镇江种质资源圃（2024年5月）。

研究结果：

3.1. 不同溶剂及浓度对黄酮提取的影响

根据“相似相溶”原理，不同极性溶剂对黄酮的溶解度不同。结果显示，水对黄酮的提取效率显著低于有机溶剂。在测试溶剂中，提取效率排序为：80%乙醇 > 乙醇 > 80%甲醇 > 甲醇 > 水（）。综合考虑提取效率、经济性、操作便利性和环境友好性，最终选择80%乙醇作为后续实验的最佳提取溶剂。

3.2. 不同温度对黄酮提取的影响

在固定其他条件并使用80%乙醇的情况下，评估了温度对提取率的影响。研究发现，在所研究的范围内，随着温度升高，提取效率提高，至60℃达到峰值。超过此温度，提取率下降，这可能是由于热敏性黄酮化合物的降解所致（）。因此，选择60℃作为后续优化的最佳提取温度。

3.3. 不同时间对黄酮提取的影响

结果显示，黄酮提取效率随提取时间延长而增加，在120分钟时达到峰值。进一步延长时间导致提取率下降，原因可能是黄酮化合物长时间暴露于细胞组分中，在热和光的影响下发生部分降解或转化（）。因此，选择120分钟用于后续研究。

3.4. 不同料液比对黄酮提取的影响

实验结果表明，随着料液比增加，黄酮提取率逐步提升，这归因于溶剂与样品接触面积增加和溶解改善。但当料液比达到1:7 g mL^-1时，进一步增加对提取率的改善微乎其微（）。因此，在平衡效率与资源消耗后，选择料液比1:7 g mL^-1用于后续步骤。

3.5. 模型拟合、统计分析及响应面解读

通过对响应面实验数据进行多元回归分析，得到了以提取时间（X₁）、料液比（X₂）和提取温度（X₃）为自变量的桑椹黄酮提取率（Y）的二阶多项式方程。方差分析（ANOVA）显示模型高度显著（F值=33.91，p值<0.0001），失拟项不显著（P=0.1414），决定系数R²=0.9776，表明模型能很好地解释响应变量的变异。提取时间（X₁）对提取率的影响最大，其次是料液比（X₂）和提取温度（X₃）。响应面三维图均呈现向下开口的曲面并具有明显峰值，表明变量间的交互作用使黄酮提取率先增后减，存在最优条件（）。

3.7. 条件优化与验证

基于响应面模型的计算分析，预测出桑椹黄酮最大提取率的最佳操作条件为：提取时间62.4分钟，料液比1:2.39，提取温度40.8℃。在此条件下的理论提取率为84.99%。为便于实际操作，将条件微调为：提取时间60分钟，料液比1:2.5，提取温度40℃。经过三次重复提取验证，平均提取率为84.11%，与预测的理论值84.96%高度吻合，验证了响应面法优化桑椹黄酮提取工艺的适用性。

3.8. 方法验证结果

对所建立的HPLC方法进行了全面验证。结果表明，13种黄酮在各自浓度范围内均表现出良好的线性（R²> 0.999）。加标回收率在98.63%至102.45%之间，相对标准偏差（RSD）< 1.0%。各化合物的检测限（LOD）和定量限（LOQ）范围分别为0.03–0.65 μg mL^-1和0.09–2.17 μg mL^-1，证明了方法的灵敏度和准确性。

3.9. HPLC方法验证与定量校准

在建立的色谱条件下，采用双波长检测模式（290 nm和365 nm）成功实现了13种黄酮标准品的基线分离。定性鉴定主要通过与相应标准品在相同色谱条件下的保留时间直接比对完成。

3.10. 桑椹样品中黄酮化合物的定量分析

将该方法应用于实际桑椹样品，成功鉴定并定量了多种黄酮成分，包括芦丁、二氢槲皮素、二氢山柰酚、槲皮素、柚皮素查尔酮、山柰酚和柚皮苷等。在不同样品中，芦丁含量为210-321 μg g^-1，二氢山柰酚为2.75-10.5 μg g^-1，二氢槲皮素为22.5-41.8 μg g^-1，槲皮素为31.7-58.6 μg g^-1。这充分证明了所建立的HPLC方法对复杂植物基质中多种黄酮组分进行定性定量分析的可行性和可靠性。

研究结论与讨论：

本研究成功建立了一套用于桑椹黄酮提取与分析的集成化高效方案。结论部分明确指出，通过响应面法优化得到的超声辅助提取最优条件（80%乙醇、料液比1:2.5、40℃、60分钟）实现了高达84.96%的总黄酮提取率，且实际验证结果（84.11%）与预测值高度吻合。同时，首次开发并验证了一种双波长HPLC方法，可同步分离鉴定桑椹中的13种黄酮化合物，该方法稳定性好、重现性高（RSD < 2%）、线性范围宽（R²> 0.9995），成为一种强大的综合质量控工具。

讨论部分深入阐释了优化工艺的价值与分析方法的意义。关于提取工艺，研究发现提取时间（X₁）的影响最为显著，且存在显著交互作用（如时间与温度X₁X₃）。这表明在超声场中，延长时间和升高温度带来的传质速率提升与某些不稳定化合物的热降解之间存在复杂的权衡关系，这也解释了为何在本研究体系中，适度缩短时间并采用较低温度反而获得了更优的提取效率。这一发现符合当前绿色提取工艺中精确能量输入的研究趋势。与传统的热回流提取相比，本工艺在显著缩短时间的同时降低了热暴露，更有利于保护桑椹中的热敏性黄酮。

关于HPLC分析方法，讨论强调本研究首次建立并验证了可同时分离定量桑椹中13种黄酮化合物的方法，涵盖黄酮醇（如芦丁、槲皮素）、二氢黄酮醇（如二氢槲皮素）和查尔酮（如柚皮素查尔酮）等多个亚类。相比以往大多只针对2-4种标志性化合物的研究，本方法在提高分析通量和获取更全面的“黄酮指纹图谱”方面迈出了关键一步，这对于准确评估桑椹产品的内在质量和实现标准化至关重要。应用于实际样品的数据分析揭示，芦丁、槲皮素和二氢槲皮素是测试样品中的主要黄酮成分，与先前关于桑椹果实化学组成的报告基本一致，同时提供了更详细的多组分定量数据。样品间含量的差异提示品种、地理来源或农艺措施可能是影响桑椹果实黄酮谱的关键因素，为后续的功能育种和原料质量控制提供了科学依据。

重要意义：本研究的创新性在于有效整合了工艺优化与先进分析技术。所建立的方案相较于传统方法展现出高效性与经济性：响应面优化的超声提取工艺在短时间内（60分钟）利用绿色安全的乙醇-水体系实现了高提取率，降低了能耗与溶剂使用。在成分全面性上，新开发的HPLC方法克服了传统技术只能检测有限组分的局限，实现了对主要黄酮成分的完整同步表征。更重要的是，它具备强大的标准化潜力：从优化提取到验证多组分分析的完整框架，为桑椹黄酮的标准化提取与检测研究提供了坚实的方法学基础和实验依据，将有力推动桑椹这一传统资源在食品、医药等领域的深度开发与高值化利用。