《Advanced Science》：Developing a Single-Cell Spatial Transcriptomics Workflow for In Vivo Evaluation of Implanted Biomaterials
文章内容归纳总结
摘要
生物材料的体内评估在很大程度上依赖于组织学来评估生物相容性和异物反应。这些方法虽能有效捕获终末结果，但对驱动组织重塑的细胞机制洞察有限，阻碍了理性设计更优生物材料的努力。转录组学已彻底改变了我们对驱动细胞功能的基因活性的理解，但在生物材料评估中仍未得到充分利用。近年来，高分辨率空间转录组学的进展使得能够精确绘制组织内的基因表达图谱，从而深入了解细胞状态和空间组织。为了将生物材料研究与空间生物学进展结合，我们针对Xenium平台开发了一套生物信息学工作流程，用于分析对植入材料的体内反应。应用此工作流程评估皮下植入小鼠的电纺聚己内酯支架，我们发现了具有独特基因表达谱且在空间上不同的巨噬细胞和成纤维细胞亚群。空间分析显示，从支架本体到其表面，共定位的巨噬细胞和成纤维细胞之间共享表型特征。基因本体分析将这些空间转变与功能角色联系起来：免疫细胞招募发生在支架内部，而纤维化发生在表面。这些转变无法通过组织学检测到，突显了空间转录组学作为揭示细胞动态并实现更好的基于生物学的生物材料设计的强大方法。
1 引言
开发新的生物材料最终需要在体内评估其性能。这是其设计过程中至关重要的迭代步骤，也常是其转化为医疗器械和组织工程构建体的最终关键里程碑。植入动物和/或人体后，传统的评估方法利用组织学技术来评估异物反应和局部组织重塑的程度。像H&E和马松三色染色这样的组织病理学染色通常用于广泛评估如植入物纤维化等组织重塑过程，而像CD68和波形蛋白这样的免疫组织化学染色则追踪特定细胞类型（如巨噬细胞和成纤维细胞），以了解细胞特异性生物反应。这些方法仍然是评估生物相容性的主要指标，并被广泛接受为决定生物材料是否与身体整合或产生不良反应的商业和临床标准。虽然这些染色突出了关键的生物学结果，但它们对潜在生物过程的细胞机制提供的见解有限。因此，当一种生物材料失败或表现出较差的生物相容性时，这种机制理解的缺乏阻碍了优化或重新设计材料的努力，因为失败的根本原因仍未确定。这使得生物工程研究领域在很大程度上依赖于迭代测试方法，而非基于对组织和应用特异性失效机制的详细理解的生物学知情重新设计。更好地理解植入物失效的体内分子机制将改变生物材料的开发，提供有针对性的优化工作流程以增强生物相容性。
组织学分析的局限性主要源于在单张切片上可同时可视化的标记物数量有限以及其在单细胞水平的空间分辨率限制。转录组学技术和分析的进步通过实现对驱动细胞行为的转录基因活性的全面分析，彻底改变了我们对复杂且相互关联的生物过程的理解。分析大量RNA转录本已发现新的细胞类型和新的信号通路，通过对疾病机制、细胞功能和治疗靶点的新见解，推动了医学研究各个领域的进展。然而，尽管具有变革性影响，转录组学尚未完全整合到生物材料设计和评估中。基因分析通常在用于组织学的不同动物队列中进行，这使得细胞结构与基因表达之间的关联变得困难。常见方法使用PCR，以及最近更先进的技术，如单细胞测序，以识别全局基因表达模式和不同的细胞群。然而，这些方法通常采用批量分析方法，掩盖了生物反应的局部变异。单个生物材料在其表面可能表现出巨大的结构、表面化学和与组织接触的异质性，每一种都可能独立影响局部细胞行为。能够捕获这些局部因素驱动的变化的空间解析基因表达，对于生物材料评估将更为有益和相关。这将更好地帮助研究人员识别局部效应、优化材料设计，并解决批量分析中不可见的特定生物相互作用。
高分辨率空间生物学技术的进步现在使得将空间成像与转录组数据结合成为可能。最近的研究结合了单细胞RNA测序与基于扩增的10x Visium空间转录组技术，来研究特定的生物学问题，如生物材料反应中的伤口愈合和纤维化。虽然这些工作提供了有价值的生物学见解，但它们侧重于有针对性的假设，以多细胞分辨率操作，并未提供一个标准化的、高分辨率的工作流程，以适应跨不同生物材料背景的单细胞空间分析。像10x Genomics Xenium平台这样的技术，允许研究人员精确定位石蜡包埋组织切片内的基因表达，从而原位详细了解细胞功能和相互作用，使用的切片与传统组织学分析兼容，并可将组织学分析应用于同一组织。Xenium平台还具有提供单细胞分辨率基因表达数据的优势，这与广泛的在线存储库和注释数据库集成，兼容大量现有的生物信息学分析工具。据我们所知，Xenium平台尚未被用于绘制体内对植入生物材料的异物重塑过程中的基因表达图谱。随着技术和分析工具的不断改进，开发一个将空间转录组学整合到生物材料评估中的框架，可能发现对生物材料设计至关重要的新通路和细胞靶点。
在本研究中，我们开发了一个标准化且可重复的生物信息学工作流程，专门针对10x Genomics Xenium平台的读出数据，实现用于体内生物材料评估的高分辨率单细胞空间转录组学分析。使用皮下植入C57BL6小鼠的电纺PCL支架的福尔马林固定石蜡包埋组织，我们展示了空间转录组学如何为异物反应提供新见解。首先评估Xenium高维数据集，以确保支架植入不影响转录本的捕获、处理或可视化。利用Seurat，我们实施了集成和亚聚类分析方法，在单细胞分辨率下分离基因谱和细胞表型。这些方法的读数显示出与第三方计算工具的兼容性，包括细胞注释和基因本体数据库，并通过与传统组织学建立的生物学基准进行正交验证。此工作流程的关键特征包括相对于支架结构的空间映射、自定义共定位指标、用于可视化潜在定向细胞状态梯度的轨迹推断以及亚聚类水平的功能注释。我们的工作流程揭示了在PCL支架内具有独特定位的不同巨噬细胞和成纤维细胞亚群。通过将这些计算工具集成到一个分步的流程中，该方法可广泛适用于生物材料评估，提供了一个可潜在应用于新材料、组织或实验设计的框架。空间共定位的自定义计算分析确定了巨噬细胞和成纤维细胞之间的转录状态的定向梯度，反映了沿支架-囊袋界面的共享表型特征，这些特征在传统组织学中不易观察到。然而，尽管我们的空间转录组学工作流程提供了对生物材料局部组织反应的详细单细胞分辨率，但它仅限于采样区域，并未捕获植入物的系统性或远端效应。因此，生物材料生物相容性的全面评估应整合高分辨率空间分析与跨多个组织和器官的传统组织学和转录组学，以充分评估局部和全身反应。这些发现展示了一个用于数据采集、预处理、空间映射和下游单细胞基因表达分析的强大且可重复的框架。通过补充和增强现有的生物材料评估方法，空间转录组学有潜力为驱动植入物失败的异物反应提供更深入的见解，并为下一代生物材料的设计提供信息。
2 方法
2.1 PCL支架制造
PCL支架使用静电纺丝技术制造。将PCL溶解在六氟异丙醇中，浓度为10% w/v，随后在室温下搅拌过夜。将制备好的溶液装入注射器，以4 mL h?1的速率通过20号针头分配。施加20 kV电压，针头与不锈钢滚筒（直径10 cm，转速500 rpm）之间的气隙为16 cm。从滚筒收集电纺支架，清洗、风干以去除任何残留溶剂，然后用活检穿孔器切成直径6 mm的圆形圆盘。
2.2 皮下植入
悉尼大学动物伦理委员会根据方案2024/2438批准了本研究。所有实验均遵守澳大利亚《用于科学目的的动物护理和使用操作规范》。使用C57BL/6雄性小鼠（9-10周龄，25±2 g）进行研究。PCL支架的体内评估采用先前报道的皮下小鼠植入模型。简而言之，每只小鼠在其背部皮下植入一个支架，持续14天，之后对小鼠实施安乐死，并收集样本用于组织学和Xenium分析。
2.3 组织处理和组织学染色
取出的组织-支架固定在4%多聚甲醛中过夜。然后样品通过梯度乙醇系列和二甲苯脱水，包埋在石蜡中，并以5 μm厚度切片。对于组织学染色，切片脱蜡、复水并用马松三色法染色。对于免疫组织化学，使用针对巨噬细胞的CD68、针对成纤维细胞的波形蛋白和针对内皮细胞的CD31的一抗。切片用含DAPI的封片剂复染细胞核，并使用Zeiss AxioScan显微镜在20倍放大倍数下成像。
2.4 空间转录组学
使用Xenium分析仪进行空间转录组学实验。石蜡包埋组织在样品制备前24小时制备在制造商载玻片上。使用无核酸酶水漂浮5 μm切片收集到制造商载玻片上，然后在60°C烘箱中风干45分钟，随后在干燥器中过夜。根据制造商说明继续进行载玻片处理，然后在Xenium仪器上进行分析，未作更改。
2.5 下游分析
使用Seurat编译和合并来自Xenium分析仪的读数。通过从主成分分析开始执行标准工作流程进行降维，其中确定了15个主成分。这些成分用于均匀流形逼近和投影降维、邻近距离计算和聚类。使用Seurat的“DimPlot”函数可视化UMAP数据，“FeaturePlot”函数可视化UMAP内单个基因的表达。使用Monocle 3进一步完成分析以生成细胞分化轨迹和伪时间分析。
2.6 细胞注释
从初始UMAP中识别出聚类。使用Seurat的“FindMarkers”函数识别每个聚类中高表达的基因，这些基因的截止参数是该聚类中至少有50%的细胞表达该基因，并且log2FC大于0.25。使用Enrichr和CellMarker 2024数据库分析来自每个聚类的基因列表以注释聚类。
2.7 基因本体分析
在对聚类进行注释后，使用相同的参数对巨噬细胞和成纤维细胞聚类进行进一步亚聚类，用于UMAP降维、邻近距离计算和聚类。将新的亚聚类映射回图像进行分析。在根据距支架表面的距离（下述）进行图像分析后，将亚聚类分类为位于支架本体内部或囊袋内。使用Seurat的“FindMarkers”函数识别这些亚聚类中高表达的基因，使用相同的截止参数。使用SRplot进行基因本体分析。
2.8 图像分析
分析Xenium Explorer 3生成的特定巨噬细胞和成纤维细胞亚群图像中细胞距支架边缘的距离以及邻近细胞。对于细胞距离，测量每个细胞到支架表面的垂直距离。负值表示在支架内部，正值表示在支架外部。借助马松三色染色手动确定支架边界。此过程使用Python自动化。
对于共定位，分析相对于皮肤组织在PCL组中显著存在的细胞亚群。在每个图像中，以每个亚群中的每个细胞为中心绘制一个25 μm的圆。测量每个圆内其他亚群细胞的数量，以确定该亚群的邻近细胞数量。对每个细胞亚群重复此过程。此过程使用Python自动化。
2.9 统计分析
使用GraphPad Prism 10进行分析。数据以均值±标准误表示。使用Student's t检验比较皮肤和PCL之间的差异。显著性水平设为p < 0.05。符号*和**分别表示P值小于0.05和0.01。
2.10 伦理批准声明
悉尼大学动物伦理委员会根据方案2024/2438批准了本研究。所有实验均遵守澳大利亚《用于科学目的的动物护理和使用操作规范》。
3 结果与讨论
3.1 空间转录本的质量指标
空间转录组学主要应用于天然未修饰组织，其在合成材料植入组织中的使用研究有限。为了验证皮下植入生物材料的存在不影响转录本捕获或读取质量，我们对来自对照小鼠皮肤组织和植入电纺PCL支架的小鼠皮肤组织的Xenium生成数据进行了质量控制分析。高质量与低质量转录本的比例在两种条件下高度可比，皮肤组织为85.2%高质量和14.8%低质量，而支架植入样本显示出几乎相同的比例：85.4%和14.6%。
使用补充质量指标，包括细胞内检测到的总体转录本百分比和未检测到转录本的细胞百分比，为转录本-细胞映射的准确性提供了见解。两组在细胞内检测到的转录本和未检测到转录本的细胞方面未观察到显著差异，表明单细胞分辨率的转录本定位未受影响。其他质量指标，如每平方微米的转录本数和每平方毫米的细胞数，显示PCL样本有显著差异，测得比对照皮肤组织增加了2.02倍。PCL样本中检测到的细胞密度增加是细胞招募增强的预期结果，突显出准确的细胞分割也未受支架植入影响。
所有捕获转录本的空间映射显示，支架植入诱导的大部分基因表达被捕获在PCL支架周围的囊袋和支架本体中。细胞分割数据的整合进一步允许了单个细胞的可视化，并识别出总转录表达最高的细胞位于PCL支架周围的囊袋和支架本体中。转录活性增加（可能由细胞密度升高引起）得到了马松三色染色的证实。相比之下，对照组织样本在皮下层表现出最小的基因表达和低细胞密度，表明这两种模式都是由对支架植入的反应驱动的。
总体而言，PCL支架的存在不干扰转录本捕获，也不影响输出数据质量或可视化。对于在生物材料评估中更广泛地应用空间转录组学，这提供了有希望的证据，表明高维转录组学数据捕获在存在具有类似多样理化特征（如疏水性和纳米拓扑结构，这些非生物组织固有）的支架时仍然可行。未来对具有不同组成、结构和表面化学的更广泛范围的生物材料进行研究，可能产生支持该领域广泛采用的关键见解。
3.2 全局转录组分析
数据集质量的验证使其能够根据已建立的计算和生物学标准评估准确性。评估所有样本的全局基因表达谱和底层高维数据集与传统生物信息学工作流程的兼容性。分层聚类热图揭示了对照皮肤和PCL组织之间不同的基因表达模式。观察到了跨多个聚类的互补基因表达模式，其中在皮肤组织中上调的基因在PCL组织中下调，反之亦然。这种转录异质性通过主成分分析得到验证，该分析确定了15个主成分，解释了≥67%的方差。皮肤和PCL样本之间主要沿PC1形成不同的聚类，PC1解释了53%的方差。这表明PCL植入诱导了不同的转录变化，正如预期的那样，证实了标准生物信息学工具可以有效地捕获支架植入组织内的广泛基因表达变化。
利用转录组数据的粒度可以实现对组织反应在基因水平上的更详细探索，这可用于广泛了解潜在的生物过程和细胞功能。通过使用火山图可视化相对于天然皮肤的PCL植入组织中差异基因表达，我们识别了数据集内显著上调的基因（log2FC ≥ 1且-log10 p值 ≥ 2）。这种方法揭示了40个基因（红点），其中Mamdc2、Oit3和Atp6v0d2上调程度最高。所有这三个基因都已被生物学验证在响应支架植入的过程中发挥关键作用。Mamdc2被认为在损伤过程中调节上皮细胞的细胞因子产生和免疫信号传导。Oit3已被证明在组织修复中调节细胞外基质产生和纤维化反应，而Atp6v0d2则与调节巨噬细胞活化和免疫调节有关。
进一步探索这些基因表达变化如何在不同的细胞群中表现，为单个细胞在周围支架-组织微环境中的功能作用提供了更深入的见解。为了识别和可视化组织样本中存在的不同细胞类型，我们结合了皮肤和PCL植入组织的转录组数据，并使用无监督聚类方法根据基因表达模式对细胞进行分组。使用一种称为UMAP的可视化技术（将多维数据简化为二维图），我们在合并的PCL和皮肤样本中发现了12个具有独特转录谱的不同细胞簇。这些簇对应一系列细胞类型，包括巨噬细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、单核细胞、干细胞、平滑肌细胞、上皮细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、中性粒细胞和神经元细胞。为了了解这些细胞簇中哪些表达了关键的上调基因，我们将Mamdc2、Oit3和Atp6v0d2的表达映射到这个UMAP图上。这显示这些基因主要在识别为巨噬细胞的簇中活跃，表明巨噬细胞可能是PCL支架植入后转录和潜在功能重塑反应的主要贡献者。
此分析与已建立的生物学知识非常吻合，因为巨噬细胞是已知的异物炎症的主要调节者。Mamdc2、Oit3和Atp6v0d2进一步突显了与炎症、纤维化和组织重塑过程一致的转录反应。这些验证支持了数据相对于异物反应期间标志性生物过程的准确性，证明了支架植入组织的转录组数据集与传统单细胞生物信息学分析兼容。
3.3 转录组簇的空间组织整合
扩展传统的生物信息学框架，整合空间数据可以实现对材料反应的更细致理解，因为生物相互作用在生物材料表面可能不同，受材料固有属性和所接触组织的异质性复杂性的影响。将Mamdc2、Oit3和Atp6v0d2转录本表达空间映射回PCL组织突显了这种异质性。转录本密度显著定位于支架囊袋和支架本体，在面向表皮而非皮下层的表面观察到更大的浓度。这种转录本的空间定位通过免疫组织化学进行了正交验证，证实了编码映射转录本的蛋白质定位于支架-囊袋界面内。此外，基因表达在支架长度上并不均匀，而是集中在支架表面的单个点。由于早期分析显示这些基因主要在巨噬细胞中表达，这表明招募到植入物面向表皮的巨噬细胞是这些组织对PCL支架反应的主要组成部分。虽然这在很大程度上是预期的，但增加的空间分辨率提供了有价值的细节，精确识别了巨噬细胞-支架相互作用发生的位置，以及这些相互作用在支架表面不同区域的变化程度。
为了实现这一点，我们首先按样本类型分离了整合的UMAP，生成了皮肤和PCL样本的UMAP图。这显示，虽然整体聚类结构在样本之间保持一致，但观察到细胞群丰度的预期变化，如巨噬细胞（右下角粉色）表示这些细胞的单个点较少。初步推测，PCL和皮肤样本之间保持不变的细胞群是在支架植入前就已存在于皮肤的组织驻留/已存在的细胞。相比之下，巨噬细胞等群的变化表明PCL支架植入触发了招募或激活反应。通过计算每个簇内细胞的频率来量化这些变化，揭示了与皮肤样本相比，PCL样本中巨噬细胞和中性粒细胞分别显著增加了2.6倍和26倍，角质形成细胞减少了2.7倍。为了可视化这些细胞-支架相互作用，然后将PCL细胞簇映射回组织，揭示了高度组织的空间分布，簇定位于支架本体、囊袋或天然皮肤内的不同区域。
此外，将此完整的转录组分析应用于独立的第3天PCL植入数据集，以进一步检查我们的流程在捕获早期免疫和组织反应方面的稳健性。主成分分析显示了第3天PCL和皮肤对照样本之间的明显分离，表明与支架植入后立即发生的急性反应一致的大量转录破坏。火山图分析确定了2610528A11Rik、Cstdc4和Cd5l为最强烈上调的基因。UMAP聚类和簇频率分析进一步表明，这种早期反应以单核细胞和巨噬细胞的显著增加以及上皮细胞的减少为特征——这是植入后初始炎症期的预期特征。顶基因的FeaturePlot映射表明，2610528A11Rik（一种与角质形成细胞相关的转录本，涉及上皮细胞活化）和Cstdc4（一种与上皮屏障维持相关的含胱抑素结构域的蛋白酶抑制剂）都在上皮和角质形成细胞簇中高表达，反映了伤口部位的表皮活化和重塑。相比之下，Cd5l（一种巨噬细胞分泌的清道夫受体相关分子，参与脂质代谢和炎症调节）在巨噬细胞簇中富集，与支架周围的早期巨噬细胞浸润和活化一致。这些发现捕获了早期植入阶段特有的急性上皮-免疫相互作用，更广泛地突显了该流程作为高分辨率工具在跨多个时间点和植入背景下解析具有生物学意义的转录动态的能力。
这些发现强调了整合空间数据与传统生物信息学方法以完善我们对生物材料-宿主相互作用理解的价值。将转录不同的细胞簇映射回组织提供了支架反应性细胞（特别是巨噬细胞）如何在植入物内部和周围定位的更精确可视化。这种空间分辨率相对于预期的免疫反应（如巨噬细胞和中性粒细胞簇的增加）得到验证，但也与预期的组织变化一致，包括角质形成细胞减少可能源于植入期间对皮肤的损伤。同时分析多个细胞类型并在单个横截面中可视化其组织的能力增强了这种能力，揭示了使用传统组织学可能被忽视的协调的细胞相互作用。以高度空间解析的方式捕获多个过程（如免疫和组织重塑）可能在将不同的细胞行为与材料特性联系起来方面广泛有益。
3.4 巨噬细胞亚聚类
为了进一步探索，我们对巨噬细胞群体进行了亚聚类，根据不同的基因表达谱将它们分组为更精细的子集。这一分析的动机是它们在PCL组织中观察到的丰度以及它们在介导异物反应中已确立的作用。首先通过免疫组织化学对巨噬细胞聚类的准确性进行正交验证。CD68染色显示与巨噬细胞簇的空间映射高度一致，该簇似乎仅限于支架本体或囊袋，支持了聚类表型分析的准确性。然后通过再次选择前15个主成分进行UMAP可视化来执行亚聚类，但这次仅关注皮肤和PCL样本中的巨噬细胞簇。这种方法识别了21个转录不同的亚群，当映射回PCL组织时，成功地将原始巨噬细胞簇揭示为这些更精细子集的复合体。
使用专门为此亚聚类地图设计的空间分析计算工具，我们量化了每个亚簇内细胞相对于支架表面的距离，区分支架本体内的细胞和囊袋内的细胞。在21个巨噬细胞亚簇中，13个定位于支架本体，5个在囊袋，3个亚簇在天然皮肤中发现。对于位于支架本体和囊袋内的巨噬细胞亚簇，我们随后进行了基因本体富集分析，这是一种使用策划的生物数据库将基因分组分类为已知细胞通路和功能的方法。从每个亚簇中选择的基因定义为log2FC > 0.25且在该亚簇中至少有50%表达的基因。支架本体内的巨噬细胞显示出对免疫细胞招募过程的最高富集，如中性粒细胞、粒细胞和白细胞趋化，而囊袋中的巨噬细胞则富集了与纤维化囊袋形成相关的过程，包括金属肽酶活性和肽酶活性以及伤口愈合的调节。这表明巨噬细胞根据其位置表现出不同的功能。在囊袋内，巨噬细胞驱动囊袋组织，而支架本体内的巨噬细胞调节免疫细胞招募。亚簇频率的进一步量化显示，巨噬细胞亚群最显著的变化发生在亚簇0-4，它们都位于支架本体，表明它们是响应支架植入的关键巨噬细胞反应者。每个亚簇的顶标记基因的补充组织学在区域水平上广泛支持了这些亚簇空间映射的准确性。
这种亚簇水平的分析在突显哪些巨噬细胞亚群被上调，表明它们在响应PCL支架植入中参与度增强方面很有价值。结合我们的定位分析工具，这五个巨噬细胞亚簇主要位于支架本体内。这可能表明内部生物材料微环境通过选择性相互作用和材料特异性线索正在塑造巨噬细胞表型。还应注意，这些巨噬细胞亚簇代表了时间上的快照，捕获了作为转录不同状态的过渡表型，进一步突显了全面巨噬细胞反应的动态异质性。捕获这种异质性表明能够推断出比单个CD68染色更深层的信息，从而允许对潜在的细胞机制和空间不同的行为形成更知情的假设。
3.5 成纤维细胞亚聚类
这种方法理论上可以进一步应用于整合的PCL和皮肤数据集中的所有剩余细胞簇，提供异物反应底层转录景观的全面视图。虽然此处未进行整个分析，但我们旨在证明整合聚类分析的局限性，这可能捕获总体细胞群变化，但忽略了亚簇水平的细微变化。正如在巨噬细胞中观察到的，亚簇分析允许检测特定亚表型的变化，这些变化可能在整合水平被掩盖，因为其他亚群的反向变化。例如，成纤维细胞在整合分析水平上未显示显著变化，但它们公认的在支架重塑和异物纤维化中的作用使其分析变得至关重要，突显了亚簇分析在整个工作流程中的实用性。
类似地，首先通过免疫组织化学对整合聚类的准确性进行正交验证。传统的成纤维细胞标记物波形蛋白染色显示与成纤维细胞簇的空间映射高度一致，该簇出现在所有支架本体、囊袋和皮肤区域。对该群体的亚聚类识别了18个转录不同的亚群，当映射回PCL组织时，同样将原始簇揭示为这些亚簇的复合体。细胞距支架距离的定位分析显示，在18个成纤维细胞亚簇中，11个定位于支架本体，4个在囊袋，3个亚簇在天然皮肤中发现。仅使用支架本体和囊袋作为空间背景，本体分析显示支架本体内的成纤维细胞显著富集伤口愈合过程，如组织重塑、对损伤的反应、止血和趋化，而囊袋内的成纤维细胞则富集与纤维化囊袋形成相关的过程，包括细胞外基质组织、结构组织和免疫反应。这表明支架成纤维细胞参与组织修复和炎症的初始阶段，而囊袋成纤维细胞更多地与纤维化包封的阶段相关，突显了其动态和空间依赖的行为。
亚簇的簇频率分析识别了5个亚群在比较PCL与皮肤样本时有显著差异，在上调和下调之
